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淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶（Lck）在T细胞受体（TCR）信号通路启动过程中起着非常重要的作用。在经典的TCR信号转导通路中，当TCR与配体结合而被激活时，最先被检测到的分子事件即是激活的Lck磷酸化CD3-ζ链中的ITAM基序上的酪氨酸残基。磷酸化的ITAM作为停泊位点招募Zap70激酶，随后招募至此的Zap70激酶因被激活的Lck磷酸化而激活，参与TCR信号的转导过程。但是，在这一信号转导过程中，Lck蛋白激酶的动态激活调节机制还没有得到很好的研究。Lck激酶活性的调节与其酪氨酸394和酪氨酸505残基的磷酸化水平密切相关。通常认为酪氨酸 505 的磷酸化抑制了 Lck 的激酶活性，它的突变会造成 Lck的持续激活。而酪氨酸394的磷酸化促进了Lck的激酶活性，它的突变则会导致Lck 激酶活性丧失，但是也有一些研究小组持有不同的看法。可见，酪氨酸 394残基在调节 Lck 激酶活性中的功能作用是有争议的。而且先前的研究报道对 Lck激酶预激活状态的存在也有争议。
通常用于研究Lck激酶活性调节的方法为生物化学方法，如Western Blot，这种经典方法并不能有效地监测活细胞中 Lck 激酶活性的动态变化。近年来，荧光共振能量转移（FRET）原理被广泛地应用于生物探针的开发，并应用于监测活细胞中激酶活性调节的动态变化。因此，在本论文中，我们通过表征一系列基于荧光共振能量转移原理的新型Lck FRET生物探针的灵敏性和特异性，开发对Lck激酶活性动态变化监测具有高灵敏性和特异性的Lck FRET生物探针， Lck-FRET-Zap70FY（ZapLck），以高时空分辨率监测活T细胞中Lck激酶的动态活性变化。利用ZapLck生物探针，我们对TCR信号转导过程中Lck激酶激活动力学进行了探究，并探究了酪氨酸394残基对Lck激酶激活的基于生物物理学的调节机制，主要实验结果总结如下：
首先，在Jurkat和Lck－缺陷型T细胞J.Cam1.6（JCam）细胞中对ZapLck生物探针的灵敏性和特异性表征结果显示，ZapLck生物探针在活T细胞中对Lck激酶活性的监测具有高度特异性和灵敏性。随后应用ZapLck生物探针，在Jurkat 和PBMC T细胞中监测到存在大量预激活状态的Lck激酶，而在Lck－缺陷型JCam细胞中，Lck的预激活水平很低。通过重组表达野生型Lck （LckWT）可以完全恢复Lck的预先激活活性，但是通过重组表达阴性突变体LckY394F不能完全恢复Lck 的预先激活活性。其次，在 JCam 细胞中表达 LckY394F，当共受体 CD3 和CD28 被 CD3／CD28 抗体复合物刺激激活时， ZapLck 生物探针监测到了LckY394F的强激活信号，且这一激活信号可以被Lck激酶抑制剂PP1所抑制。若JCam_LckY394F 细胞预先用 PP1 处理，CD3／CD28 抗体复合物刺激下则检测不到激活信号。说明在CD3/CD28抗体复合物激活的TCR信号转导过程中，LckY394F表现出了激酶活性。
随后，我们利用ERK蛋白激酶生物探针（ERK Biosensor）对Lck下游分子ERK进行激酶活性监测，结果表明LckY394F在CD3/CD28抗体复合物刺激下将TCR信号有效地转导至下游分子ERK。进一步分析ERK生物探针监测结果发现， T细胞中存在依赖于和不依赖于Lck激酶的ERK信号通路，且Lck激酶介导ERK的快速激活。通过分析单细胞中 Lck 表达水平与其本底活性之间的关系发现，单细胞中Lck本底活性与LckY394F的表达水平呈线性相关关系，但是Lck本底活性与LckWT的表达水平呈非线性相关关系。通过FRAP实验，我们比较了Lck及其突变体之间的分子扩散速率，结果显示，LckY394F本底扩散速率比LckWT的本底扩散速率快。在CD3/CD28抗体复合物刺激之后，LckWT和LckY394F的扩散速率都下降到相似的水平。最后，利用BiFC-split Venus体系，在LckWT和LckY394F的C-末端分别连接VN173和VC155片段，通过比较抗体复合物刺激前后Venus荧光强度，我们发现抗体复合物刺激后LckWT和LckY394F的Lck-Lck相互作用增强，且LckY394F的增强幅度更大。这些结果表明LckWT中酪氨酸394的磷酸化可能有助于其本底水平聚集，扩散较慢，与邻近 LckWT 分子相互作用，进而导致它的预激活。LckY394F缺乏这种预聚集和预激活，抗体介导的连接和聚集足以引起LckY394F的聚集并触发它完全激活。
根据以上数据我们推测LckWT和LckY394F的相互作用和活化机理：在静息状态下，LckWT在T细胞膜上以预激活状态通过磷酸化Y394形成复合物。在抗原结合后，活化的 LckWT 可进一步活化并与 TCR/CD3 复合物聚集。突变体LckY394F 分子相对来说在静息状态下是未结合和未激活的，但是它们可以被CD3/CD28 抗体复合物刺激激活并导致聚集，其激活和聚集程度与 LckWT 相似。综上所述，新型ZapLck FRET生物探针能够特异性监测单个活T细胞中Lck激酶的激活动力学变化，揭示了LckY394F的生物物理作用以及酪氨酸394残基在介导Lck分子间相互作用，指导激酶激活时的磷酸化的机制。
通常用于研究Lck激酶活性调节的方法为生物化学方法，如Western Blot，这种经典方法并不能有效地监测活细胞中 Lck 激酶活性的动态变化。近年来，荧光共振能量转移（FRET）原理被广泛地应用于生物探针的开发，并应用于监测活细胞中激酶活性调节的动态变化。因此，在本论文中，我们通过表征一系列基于荧光共振能量转移原理的新型Lck FRET生物探针的灵敏性和特异性，开发对Lck激酶活性动态变化监测具有高灵敏性和特异性的Lck FRET生物探针， Lck-FRET-Zap70FY（ZapLck），以高时空分辨率监测活T细胞中Lck激酶的动态活性变化。利用ZapLck生物探针，我们对TCR信号转导过程中Lck激酶激活动力学进行了探究，并探究了酪氨酸394残基对Lck激酶激活的基于生物物理学的调节机制，主要实验结果总结如下：
首先，在Jurkat和Lck－缺陷型T细胞J.Cam1.6（JCam）细胞中对ZapLck生物探针的灵敏性和特异性表征结果显示，ZapLck生物探针在活T细胞中对Lck激酶活性的监测具有高度特异性和灵敏性。随后应用ZapLck生物探针，在Jurkat 和PBMC T细胞中监测到存在大量预激活状态的Lck激酶，而在Lck－缺陷型JCam细胞中，Lck的预激活水平很低。通过重组表达野生型Lck （LckWT）可以完全恢复Lck的预先激活活性，但是通过重组表达阴性突变体LckY394F不能完全恢复Lck 的预先激活活性。其次，在 JCam 细胞中表达 LckY394F，当共受体 CD3 和CD28 被 CD3／CD28 抗体复合物刺激激活时， ZapLck 生物探针监测到了LckY394F的强激活信号，且这一激活信号可以被Lck激酶抑制剂PP1所抑制。若JCam_LckY394F 细胞预先用 PP1 处理，CD3／CD28 抗体复合物刺激下则检测不到激活信号。说明在CD3/CD28抗体复合物激活的TCR信号转导过程中，LckY394F表现出了激酶活性。
随后，我们利用ERK蛋白激酶生物探针（ERK Biosensor）对Lck下游分子ERK进行激酶活性监测，结果表明LckY394F在CD3/CD28抗体复合物刺激下将TCR信号有效地转导至下游分子ERK。进一步分析ERK生物探针监测结果发现， T细胞中存在依赖于和不依赖于Lck激酶的ERK信号通路，且Lck激酶介导ERK的快速激活。通过分析单细胞中 Lck 表达水平与其本底活性之间的关系发现，单细胞中Lck本底活性与LckY394F的表达水平呈线性相关关系，但是Lck本底活性与LckWT的表达水平呈非线性相关关系。通过FRAP实验，我们比较了Lck及其突变体之间的分子扩散速率，结果显示，LckY394F本底扩散速率比LckWT的本底扩散速率快。在CD3/CD28抗体复合物刺激之后，LckWT和LckY394F的扩散速率都下降到相似的水平。最后，利用BiFC-split Venus体系，在LckWT和LckY394F的C-末端分别连接VN173和VC155片段，通过比较抗体复合物刺激前后Venus荧光强度，我们发现抗体复合物刺激后LckWT和LckY394F的Lck-Lck相互作用增强，且LckY394F的增强幅度更大。这些结果表明LckWT中酪氨酸394的磷酸化可能有助于其本底水平聚集，扩散较慢，与邻近 LckWT 分子相互作用，进而导致它的预激活。LckY394F缺乏这种预聚集和预激活，抗体介导的连接和聚集足以引起LckY394F的聚集并触发它完全激活。
根据以上数据我们推测LckWT和LckY394F的相互作用和活化机理：在静息状态下，LckWT在T细胞膜上以预激活状态通过磷酸化Y394形成复合物。在抗原结合后，活化的 LckWT 可进一步活化并与 TCR/CD3 复合物聚集。突变体LckY394F 分子相对来说在静息状态下是未结合和未激活的，但是它们可以被CD3/CD28 抗体复合物刺激激活并导致聚集，其激活和聚集程度与 LckWT 相似。综上所述，新型ZapLck FRET生物探针能够特异性监测单个活T细胞中Lck激酶的激活动力学变化，揭示了LckY394F的生物物理作用以及酪氨酸394残基在介导Lck分子间相互作用，指导激酶激活时的磷酸化的机制。