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研究背景：近年来,随着经济的高速发展,人们生活水平逐渐提高,全球糖尿病的患病率急剧升高,糖尿病已成为威胁人类健康的第三大杀手。在刚刚闭幕的第十次全国内分泌学学术会议上,大会主席宁光教授介绍了我国《2010糖尿病专题调查》的结果。调查显示,我国2010年糖尿病患病率与2007年调查得出的9.7%相近,其中男性10.24%,女性9.05%。因此,遏制糖尿病的流行刻不容缓。然而,糖尿病随着治疗的进展传统口服降糖药物、手术、胰岛素等各种治疗手段的缺陷日益凸显,已不能阻止胰岛β细胞的进行性衰竭,同样,胰岛移植因胰岛来源匮乏、移植物活力下降及移植后免疫排斥反应一直限制着胰岛移植的开展。因此,探寻促进胰岛细胞增殖、增强胰岛细胞功能以及抑制胰岛细胞凋亡的活性物质成为糖尿病领域研究的热点和难点。近年来,胰高血糖素样肽-1在促进胰岛β细胞的增殖及减少其凋亡方面备受关注。它可促进胰岛细胞增殖、减少凋亡、增加胰岛细胞数量,但其应用于临床出现较多不良反应,以胃肠道反应最为常见,且价格昂贵,不易普及。因此,开发出一种能促进胰岛细胞增殖、抑制胰岛细胞凋亡,且不良反应少、制作工艺简单、价格低廉的药物具有更重要的意义。本研究采用一种以糖尿病发生的源头器官胰腺为靶点,从幼龄小猪的新鲜胰脏中提取的小分子活性物质溶液—胰腺小分子活性肽为研究对象,此提取液PH值为6.0-7.0,每1mL提取液中含多肽不少于15mg,且不含胰岛素,因其以动物胰腺为原料,故与胰岛细胞具有更好的相容性,且有可能含有胰腺发育分化相关的蛋白及生长因子等。前期实验已观察到其对胰岛p细胞株的作用,实验结果显示胰腺小分子活性肽在一定浓度下可促进胰岛细胞增殖。本实验则将其应用于SD大鼠原代胰岛细胞,从以下两方面进行初步探讨：1、观察胰腺小分子活性肽对大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响。2、了解胰腺小分子活性肽对过氧化氢诱导体外大鼠胰岛细胞凋亡的影响,检测细胞凋亡率及Bcl-2、Bax、 Caspase3mRNA的表达,观察相关蛋白Bcl-2及Bax的表达,初步探讨其作用机制。第一部分胰腺小分子活性肽对过氧化氢诱导体外大鼠胰岛细胞凋亡的影响目的：观察胰腺小分子活性肽对过氧化氢诱导体外大鼠胰岛细胞凋亡的影响。方法：(1)大鼠胰岛细胞分离、纯化：采用胶原酶P胆总管灌注消化,Ficoll-400不连续密度梯度纯化SD大鼠胰岛,后置于37℃,5%CO2培养箱中培养。(2)实验分组与处理：分离、培养的胰岛细胞分为A-E组：A为正常对照组：加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养；B-E组培养液中分别加入终浓度为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL胰腺小分子活性肽,每组细胞设4个复孔(n=4),各组细胞培养5d后分别加入终浓度为100μmol/L的过氧化氢共育1h。(3)过氧化氢(H202)诱导大鼠胰岛细胞凋亡的形态学观察：细胞分组同(2)部分。各组细胞分别加入终浓度为100μmol/L的过氧化氢共育1h后,采用Hoechst33258核染色形态学观察。(4)胰腺小分子活性肽对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠胰岛细胞凋亡的影响：细胞分组同(2)部分。各组细胞分别培养5d后,经100μmmol/L的过氧化氢成功诱导其发生凋亡,采用Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡率。(5)胰腺小分子活性肽对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠胰岛细胞Bax、Bcl-2及Caspase3基因的影响：细胞分组同(2)部分。各组细胞干预5d后经100μmol/L的过氧化氢成功诱导其发生凋亡,荧光定量PCR法检测各组细胞Bax、Bcl-2及Caspase3mRNA的表达。(6)胰腺小分子活性肽对过氧化氢(H202)诱导大鼠胰岛细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响：细胞分组同(2)部分。各组细胞干预5d后经100μmol/L的过氧化氢成功诱导其发生凋亡,Westerm-blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果：(1)胰腺小分子活性肽对过氧化氢(H202)诱导大鼠胰岛细胞凋亡的影响：AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒测定各组细胞在H2O2诱导凋亡下的细胞凋亡率,流式细胞仪进行检测,定量分析的结果示：不同因素干预后的胰岛细胞凋亡率各组间比较有显著差异(P=0.000),多重比较结果显示：除100μg/mL胰腺小分子活性肽组和200μg/mL胰腺小分子活性肽组外,其余两组细胞凋亡率均显著低于空白对照组(P均<0.01),后两组之间差异无统计学意义(P>O.05)。(2)胰腺小分子活性肽对过氧化氢(H2O2)诱导大鼠胰岛细胞Bax、Bcl-2及Caspase3基因的影响：胰腺小分子活性肽干预5d后大鼠胰岛细胞荧光定量PCR结果示：各处理组间Bax mRNA表达有显著差异(P=0.000)。除100μg/mL和200μg/mL胰腺小分子活性肽外,其余两组Bax mRNA表达均低于空白对照组(P均<0.05)；且后两者间比较Bax mRNA表达差异无统计学意义(P>O.05)。同时,各组间Bcl-2mRNA表达有显著差异(P=0.000)。除100μg/mL胰腺小分子活性肽和200μg/mL胰腺小分子活性肽组外,其余两组Bcl-2mRNA表达均高于空白对照组(P均<0.05),而后两者比较差异有统计学意义(P<0.05),400μg/mL胰腺小分子活性肽组Bcl-2mRNA表达高于300μg/mL胰腺小分子活性肽组。另外,各处理组间Caspase3mRNA表达有显著差异(P=-0.000)。除100μg/mL和200μg/mL胰腺小分子活性肽组外,其余两组Caspase3mRNA表达均低于空白对照组(P均<0.05)；且后两者间比较Caspase3mRNA表达差异无统计学意义(P>O.05)。(3)胰腺小分子活性肽对过氧化氢(H202)诱导大鼠胰岛细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响：药物干预5天后大鼠胰岛细胞Bax、Bcl-2蛋白表达定量结果示：各处理组间Bax蛋白表达有显著差异(P=0.001)。除100μg/mL和200μg/mL胰腺小分子活性肽组外,其余两组Bax蛋白表达均低于空白对照组(P均<0.05)；且后两组间Bax蛋白表达比较无统计学差异(P>O.05)。同时,各处理组间Bc1-2蛋白表达有显著差异(P=0.000)。除100μg/mL胰腺小分子活性肽和200μg/mL胰腺小分子活性肽组外,其余两组Bcl-2蛋白表达均高于空白对照组(P均<0.05),且后两组间比较Bc1-2蛋白表达无统计学差异(P>O.05)。结论：胰腺小分子活性肽在较高浓度时对大鼠胰岛细胞凋亡有明显保护作用。第二部分胰腺小分子活性肽对大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响目的：观察胰腺小分子活性肽对体外培养大鼠胰岛细胞增殖活性及功能的影响。方法：(1)大鼠胰岛细胞分离、纯化及培养：具体操作同第一部分(1)。(2)实验分组与处理：将胰岛细胞分为空白对照组和实验组,空白对照组加入普通培养基,实验组培养基中加入不同质量浓度(100,200,300,400μg/mL)胰腺小分子活性肽。(3)胰腺小分子活性肽对大鼠胰岛细胞增殖的影响：细胞分组同(2)部分。各组细胞处理完毕后,在37℃,5%CO2培养箱中分别培养1d、3d或5d, CCK-8法检测细胞增殖活性。(4)胰腺小分子活性肽胰腺小分子活性肽对大鼠胰岛细胞功能的影响：细胞分组同(2)部分。各组细胞培养5d后,分别用3.3mM葡萄糖和16.7mM葡萄糖的KRBH液刺激2h,放射免疫法检测胰岛素分泌量。结果：(1)胰腺小分子活性肽对大鼠胰岛细胞增殖的影响：不同时间细胞增殖活性有统计学差异(P=0.032)。干预1d、3d或5d,各处理组组间细胞增殖活性均有显著性差异(P均为0.000)。固定时间,各组单独效应及多重比较显示：培养1d、3d及5d时,除100μg/mL和200μg/mL胰腺小分子活性肽组外,其余两组细胞增殖活性显著高于空白对照组(P<0.05),各组间两两比较差异均有统计学差异(P均<0.05)。不同处理细胞增殖活性有显著差异(P=0.000)。除400μ g/mL胰腺小分子活性肽组外,其他四组在不同干预时间细胞增殖活性均无显著性差异(P=0.694;P=0.772;P=0.417;P-0.801),400μg/mL胰腺小分子活性肽组细胞培养5d后的增殖活性显著高于1、3d(P均<0.05),而1d与3d之间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)胰腺小分子活性肽对大鼠胰岛细胞功能的影响：经胰腺小分子活性肽干预5d后,低糖刺激后胰岛素的分泌量各组间有显著差异(P=0.000),除100μ g/mL组和200μg/mL组外,其余两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P均<0.05),且300μg/mL胰腺小分子活性肽组与400μg/mL胰腺小分子活性肽组比较无统计学差异(P>0.05)。高糖刺激后胰岛素的分泌量各组间比较有显著差异(P=0.008),除100μg/mL组和200μg/mL组外,其余两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P均<0.05),且300μg/mL与400μg/mL组比较无统计学差异(P=0.05)。胰岛素刺激指数各组比较有统计差异(P=0.011),除100μg/mL组和200μg/mL组外,其余两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P均<0.05),且300μg/mL与400μg/mL组比较无统计学差异(P=0.05)。结论：胰腺小分子活性肽在较高浓度时不仅可促进胰岛细胞增殖,而且可显著增强胰岛细胞分泌胰岛素的功能。