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本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 MmpL3蛋白调节分枝菌酸运输的结构与分子机制研究 作为人类生命和健康的主要杀手之一，结核病与人类的斗争历史已经有一百年之久，导致了数亿人的死亡。尽管目前已有多种用于治疗结核的一线和二线药物上市，如抗菌类药物异烟肼(Isoniazid，INH)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)和吡嗪酰胺(Pyrazinamide)以及抗生素类药物利福平(Rifampicin，RIF)等等，遗憾的是，这些药物都已经被证明具有非常大的毒副作用；而且，由于抗生素类药物的使用方法不当，导致了多重耐药性、极端耐药性及全耐药性结核杆菌的出现，这些因素都不同程度地加剧了结核病治疗的难度。上述情况在中国、印度等发展中国家尤为严重。因此，开发出针对新型靶点且高效特异的新药，对全球范围内控制疾病疫情的发展具有重要意义。 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)是引起人类结核病的单一病原菌。该菌细胞壁的结构非常特别，是由分枝菌酸和多糖阿拉伯半乳聚糖在细胞膜外形成的多糖层。由于细胞壁与Mtb的细胞毒力密切相关，涉及它代谢的关键基因是新型抗结核药物靶标的研究重点之一。研究表明，海藻糖单霉菌酸酯（分枝菌酸的主要存在形式之一）的跨膜转运蛋白——结核杆菌大膜蛋白3（mycobacterial membrane protein large3，MmpL3），在分枝菌酸跨膜转运和血红素铁的摄入中有关键的作用。全细胞筛选及结核杆菌突变型菌株研究鉴定出的抗结核菌化合物SQ109、AU1235作用位点均位于MmpL3上。鉴于分枝菌酸的转运及Fe元素的摄入与结核分枝杆菌的存活和毒力的密切关系，所以MmpL3蛋白质结构的解析是为抗结核新药的研发和药物改造提供潜在靶点、为人类有效对抗结核病的重要手段。 MmpL3蛋白属于耐药结节细胞分化（Resistence/Nodulation/Cell-Division，RND)超家族，它与RND家族已有结构的其它成员之间，例如AcrB，MexB，CusA，MtrD和ZneA等的序列相似性约为30％。笔者希望通过对MmpL3转运蛋白结构的研究，不仅从原子水平阐释分枝菌酸和铁离子跨膜转运的分子机制并为靶向MmpL3的TB治疗提供帮助。 本研究利用大肠杆菌BL21表达系统，建立了MmpL3稳定的蛋白表达纯化体系。实验证明，在经过亲和层析纯化以及分子排阻层析纯化后的蛋白，其纯度可达到80％以上。对MmpL3蛋白的C端截短改造明显提高了蛋白质的稳定性，改善了蛋白的多位点降解现象。另外，笔者根据蛋白质二级结构预测信息以及其家族成员MmpL11的可溶性胞质结构域D2的晶体结构，进一步对MmpL3截短体的胞外Loop区进行了6×His的突变，大大提高了蛋白的稳定性。本文的研究加深了对MmpL3生化性质的理解，为以后MmpL3的晶体生长和功能研究积累了经验。 第二部分 牛病毒性腹泻病毒中NS3解旋酶的晶体结构 牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的主要成员，更是全世界范围内造成畜牧业巨大经济损失的重要病原体。BVDV主要宿主为牛，以发热、腹泻、咳嗽为主要症状，造成生产、繁殖能力下降，具有高度传染性和致死性。 BVDV的NS3蛋白分子量大约为76kDa，含有两个相对独立的功能结构区:N端糜蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶活性区和C端核苷三磷酸酶/RNA解旋酶（RNA helicase）活性区。NS3蛋白通常以NS2/3和单独的NS3两种形式存在，研究表明，基因重组、插入、突变等都会引起单独的NS3蛋白的表达，从而导致非细胞病变型(non-cytopathogenic，NCP) BVDV向致细胞病变型(cytopathogenic，CP)BVDV的转变因此，NS3蛋白是致细胞病变型(cytopathogenic，CP) BVDV的一个重要分子标志，遗憾的是，至今仍然缺少NS3功能蛋白酶相关的结构生物学研究的报道。 在这里，笔者通过与上海科技大学免疫化学研究所的石军超同学以及李胜老师的合作，对BVDV的NS3蛋白的解旋酶区域(约53kDa，以下称为bNS3h)进行了克隆的构建及纯化，并解析了2.8A分辨率的bNS3h的晶体结构。通过对不同病毒的NS3解旋酶的序列及结构的比对分析发现，在三个结构域中，D1和D2有更高的保守性，而D2结构域的柔性区域似乎与功能存在更大的相关性。BVDV的NS3晶体结构的解析有助于我们深入了解瘟病毒属NS3解旋酶结构与功能的关系，为揭示NS3在病毒生命活动中的关键作用提供新的结构视角。