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第一部分:Db/db小鼠肾脏中核基因Tribble3的表达及其与肾脏纤维化的关系 背景 糖尿病是一种全球疾病，而且其在全球范围的增长速度非常快。糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病重要的微血管并发症之一，还是糖尿病患者主要的致残、致死原因，其发病率也在不断升高。DN已成为终末期肾病(end-stagerenaldisease，ESRD)的主要原因之一。现在越来越多证据表明，糖尿病肾病最终会演变成肾脏纤维化，而其具体发生机制仍未完全阐明。因此，深入研究探讨糖尿病肾病的分子发生机制，为延缓糖尿病肾病发展进程提供新的科学理论依据是具有长远意义的。 DN的发病机制复杂，其发生与发展包括多种因素:高血糖、高血脂、高血压以及蛋白尿等。高血糖(Hyperglycemia)作为糖尿病的基本临床症状，是引起糖尿病诸多并发症的主要原因，同样也是DN的主要致病因素。高血糖能够刺激肾脏固有细胞和非固有细胞分泌产生多种炎症介质和细胞因子造成肾脏结构和功能的改变，这是目前一致认可DN发病机制。 Tribbles基因是2000年在果蝇体内新发现的神经细胞死亡诱导蛋白激酶，它是一种核基因，可以抑制细胞有丝分裂、诱导细胞凋亡。Tribbles基因作为一个“脚手架蛋白”(scaffoldproteins)，可以在多条信号通路上发挥重要作用。其家族成员TRB3定位于人类染色体20p13-p12.2，而2型糖尿病的相关基因也定位于此位置，提示TRB3与糖尿病有着天然的联系。TRB3可以参与多种细胞的增殖分化调节，在肝脏、脾脏、胰腺、胸腺、心脏和肾脏中均有表达。Du等发现与野生小鼠相比，在db/db小鼠的肝脏中TRB3的mRNA和蛋白表达量明显升高，TRB3表达量的升高促进了血糖及糖耐量升高。刘进稳等研究发现TRB3的表达量与通过结扎单侧输尿管建立的纤维化模型肾脏组织的纤维化程度呈正相关，由此看出，TRB3不仅与血糖调节相关，而且可能参与了纤维化的发生发展过程。然而，我们并未看到关于TRB3是否参与了糖尿病肾病的肾脏纤维化发展的相关研究。 目的 1.探讨TRB3在db/db小鼠肾脏中的表达; 2.探讨TRB3与db/db小鼠肾脏TGF-β1的表达及其与纤维化程度的相关性。 方法 12周龄雄性C57BL/KSJ背景2型糖尿病肾病db/db小鼠15只及同周龄db/m小鼠15只，其中db/db小鼠为糖尿病肾病模型组（DN组），db/m小鼠为正常对照组（C组），所有动物均标准饲料喂养。实验过程中进行下列指标监测:(1)每周监测随机血糖1次。(2)两组小鼠分别在16、20、25周龄取材，取材前1d，收集各小鼠24h尿液，测定尿蛋白浓度并计算24h尿蛋白量(UAE)。(3)取材前将所有小鼠禁食12h并称其体质量(BW)，心脏取血进行血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)检测。(4)通过苏木精-伊红(HE)染色、高碘酸-无色品红(PAS)染色、马松三色(Masson)染色观察肾组织病理改变，并计算肾小球系膜基质相对面积和间质纤维化程度。(5)免疫组化法检测TRB3蛋白在小鼠肾组织中的表达。(6)RT-PCR、Westernblotting分别检测TRB3、转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA及蛋白水平的变化。 结果 1.生化指标 C组随机血糖保持平稳，而DN组血糖升高趋势明显，且在16周时两组血糖差异具有统计学意义（P＜0.01）。与同周龄C相比，DN的UAE、Scr和BUN均明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。 2.肾组织病理 两组小鼠均未发现典型糖尿病肾病的K-W结节性表现及明显的间质纤维化。3个时间点C组小鼠肾小球及系膜区均未见明显异常改变及PAS阳性物质;DN组可见毛细血管壁和系膜区PAS染色阳性，肾小球肥大，毛细血管基底膜增厚，系膜基质增多，系膜区增宽。两组小鼠肾小球系膜及基底膜相对面积在20、25周龄时有显著差异（P＜0.01），肾间质纤维组织相对面积在16、20、25周龄时有显著差异（P＜0.01）。 3.免疫组织化学染色检测TRB3 结果显示TRB3在两组小鼠的肾脏组织中都有表达，且表达于肾小球固有细胞及肾小管上皮细胞的胞核内。 4.实时定量PCR、免疫印迹Westernblotting检测 与C组相比，20、25周DN组TRB3、TGF-β1mRNA显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，20周TRB3蛋白，25周TRB3、TGF-β1蛋白水平均显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，且均随病程进展呈上升趋势。 5.相关性分析 DN组TRB3蛋白表达与TGF-β1表达水平呈正相关(r=0.944，P＜0.01)，并且与肾间质纤维化程度具有正相关性（r=0.857，P＜0.05）。 结论 1.Db/db鼠，在Leptin受体基因上存在G→T点突变，肾小球肥大、蛋白尿及肾小球硬化等肾脏畸形在db/db鼠上的表现非常显著，与人类糖尿病肾病具有明显相似性。 2.肾小球肥大，毛细血管基底膜增厚，系膜区增宽，PAS染色阳性是糖尿病肾病的主要病理改变。 3.TRB3在小鼠肾脏组织中有表达。 4.与同周龄db/m小鼠相比，TRB3在db/db小鼠肾脏组织中表达量升高，且与TGF-β1的表达量及间质纤维化程度存在明显正相关，提示TRB3可能参与糖尿病肾病肾脏纤维化的发生发展过程。 第二部分:Tribble3在高糖对小鼠肾小球系膜细胞基质蛋白合成的影响中的作用及其信号转导机制 背景 许多研究已经证实，肾小球硬化和间质纤维化是糖尿病肾病(DN)的主要病理特征[1]，尤其是在DN发展的中后期。其中，细胞外基质(ECM)的沉积是导致肾小球硬化的主要病理改变，如由TGF-β1调节的多种胶原蛋白、纤连蛋白(FN)的积聚[2]。DN的发病中，在ECM的沉积与系膜膨胀过程中肾小球系膜细胞起重要作用[3]，TGF-β1是ECM合成的核心细胞因子，它对于糖尿病条件下系膜的纤维化与肥大有重要作用[4]。大量研究显示，ECM的主要成分是Ⅰ-Ⅳ型胶原蛋白及其一系列代谢产物[5]。 MAPKs是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白调节激酶，MAPK链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，此信号通路在基因表达调控过程中发挥关键作用。MAPK含有三个经典的亚家族途径，包括细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)，P38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)。有研究结果显示p38MAPK和JNK在糖尿病肾病的肾脏组织中活性均显著增强[6,7]，这表明MAPK信号通路与DN是密切相关的。 假性激酶Tribble3(TRB3)可以控制细胞应激和生长及代谢，与胰岛素抵抗的发生具有相关性。最新研究发现TRB3可与TGF-β1的下游信号因子Smad3相互作用，增强TGF-β1信号通路的活性，可能在纤维化的进展中以诱导上皮-间叶转化的方式发挥促进作用，而且早已有临床研究证实TRB3R84变构体与2型糖尿病引发的慢性肾病有关[8,9]。MAPK链作为真核生物基础的信号通路与其他诸多通路存在广泛的交互作用，许多信号通路最终都要和MAPK通路发生“cross-talk”。Trbs作为调节MAPK活性的关键因子以及MAPK信号通路在DN发病中的重要作用为trb3可能参与DN发病提供了有力的理论依据。 动物实验中我们得出结论TRB3在db/db小鼠的肾脏组织中表达量升高，且与纤维化因子TGF-β1的表达量及间质纤维化程度呈正相关，此结果提示我们核基因TRB3可能在糖尿病肾脏纤维化的发展过程中发挥一定的作用。此外，最近有研究表明TRB3是MAPKs活性的重要调节因子。Kiss-Toth等发现TRBs对MAPK信号转导途径的连锁反应具有广泛和特异的调控作用[10-12]，在MAPK、PI3K/AKT、PPAR等多条重要的信号转导途径调控中位于“bottlenecks”的关键位置。 据此，我们提出TRB3可通过对MAPK信号途径活性的调节继而直接参与DN发病或间接地通过调控TGF-β1活性参与DN发病的重要机制的假设。 目的 利用细胞转染实验进一步探讨糖尿病肾病中TRB3对ERK1/2-MAPK和TGF-β1/Smad两条信号通路活性的调控作用，以及对糖尿病肾病肾脏纤维化因子TGF-β1和Ⅳ型胶原蛋白合成的影响。 方法 本研究以永生化小鼠肾小球系膜细胞SV40MES13（MMCs）为研究对象。采用实时定量荧光PCR(RT-PCR)，蛋白免疫印迹(westernblotting)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等实验方法，分别做以下试验观察: 1.按照培养环境不同将细胞大体分为低糖组、高渗组、高糖组，即分别给予葡萄糖（5.5mmol/L）、甘露醇（25mmol/L）、葡萄糖（25mmol/L）孵育MMCs，检测TGF-β1、TRB3、collagentypeⅣ(Col-Ⅳ)mRNA及蛋白含量; 2.低糖、高渗、高糖环境刺激MMCs一定时间后，观察ERK1/2-MAPK信号通路活性的变化; 3.设计、化学合成TRB3小干扰RNA，通过脂质体转染MMCs抑制TRB3表达后，观察高糖刺激对ERK1/2-MAPK磷酸化水平及细胞合成TGF-β1、Col-Ⅳ的mRNA、蛋白含量的变化; 4.给予ERK1/2-MAPK特异性通路阻断剂PD98059后，高糖对MMCs合成TGF-β1、Col-Ⅳ、TRB3的影响。 结果 1.分别以低糖、高渗、高糖条件孵育MMCs0h、6h、12h、24h、48h。48h内，高糖时间依赖性刺激MMCsTRB3、TGF-β1、Col-ⅣmRNA及蛋白质合成，mRNA合成量在12h达到峰值，蛋白合成量在48h达到峰值（P＜0.01），而高渗组无明显改变，差异无统计学意义; 2.高糖刺激24h以内，ERK1/2磷酸化水平呈时间依赖性升高，在24h时达到峰值水平（P＜0.01）; 3.筛选最佳抑制效果TRB3小干扰RNA抑制TRB3表达后，高糖刺激MMCs12h，TGF-β1、Col-ⅣmRNA显著下降(P＜0.01)，高糖刺激MMCs24h，TGF-β1、Col-Ⅳ蛋白显著下降(P＜0.01); 4.PD98059可抑制高糖引起的TGF-β1、Col-ⅣmRNA及蛋白下降(P＜0.01)，但TRB3蛋白表达确明显升高（P＜0.01）。 结论 1.高糖通过ERK1/2-MAPK信号转导通路促进细胞因子TGF-β1、Col-Ⅳ的合成; 2.高糖是TRB3的刺激因子之一，TRB3通过ERK1/2-MAPK信号转导通路参与TGF-β1、Col-Ⅳ的合成代谢; 3.核基因TRB3与ERK1/2-MAPK信号通路下游的某些细胞因子之间可能存在反馈调节。