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生物制氢技术以其常温、常压、能耗低、环保等特性,已经引起各国科学家的高度重视。在目前备受关注的几种生物制氢方法中,以废弃生物质为底物的发酵法生物制氢,是更接近实用技术的方法。近年来的研究结果表明,暗发酵与光发酵产H2在底物利用方面具有很好的互补性,暗-光发酵耦联制氢技术不仅可以提高底物向产氢的转化效率,还可以达到发酵液上清直接排放的清洁标准,为生物质向氢能的转化提供了一种理想的清洁生产途径。本论文以进一步提高暗、光发酵法制氢的效率为研究目标,在混合菌群暗发酵过程中微生物组成与产H2效率关系的解析、高效产H2菌株的筛选与产H2条件的优化以及利用自然光的光发酵制氢等方面展开了研究。具体研究内容包括以下五个部分:1.利用不同底物进行暗-光耦联两步法生物制氢的研究。针对寻找合适原料这一开发生物能源面临的重要问题,选择能源作物木薯（Manihot esculenta Crantz）和废弃物厨余垃圾为底物,进行暗-光耦联两步法生物制氢的可行性研究。通过暗发酵产H2,木薯、厨余垃圾及对照蔗糖三种底物产H2量分别为212,226和223 mL/g-底物。再通过类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）ZX-5利用三组暗发酵液厌氧光照产H2,产H2量分别达到611±11 mL/g、451±20 mL/g和565±13 mL/g。通过暗-光耦联两步法产H2,产H2量比仅暗发酵高出2-3倍,并且发酵液COD去除率达80%以上。结果表明,木薯粉和厨余垃圾是暗-光耦联两步法生物制氢理想的生物质资源,所建立的暗光耦联两步法产H2体系,不仅可以把包括废弃物在内的生物质等更加彻底地转化成清洁能源氢气,同时也避免了暗发酵产生的有机酸所带来的环境污染。2.解析10L连续搅拌式罐式反应器（CSTR）暗发酵产H2过程中优势微生物的演替规律。通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析16S-rRNA组成的多态并测序分析相关DGGE条带,以及采用实时定量PCR（qrt-PCR）和基于铁氢酶hydA的DNA及cDNA克隆建库等技术解析系统菌群结构与产H2效率之间的关系。分析结果表明:从接种到产H2结束的不同时期,系统中优势菌群存在明显的演替,产H2前期为好氧的芽胞杆菌（Bacillus）,产H2初期开始出现拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）,而产H2旺期以拜氏梭菌和产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为优势菌,产H2末期又逐渐出现了另一些能够利用蛋白的梭菌,而且反应器中氧化还原电位（ORP）的变化与优势菌群的演替及产H2速率一致。基于hydA基因构建的DNA和cDNA文库,得到一个反映不同时期产H2菌种类和丰度的动态变化图。通过qrt-PCR研究不同时段hydA基因的表达,发现系统中总hydA的表达水平在稳定期达到峰值,而单位产H2菌的相对hydAmRNA表达水平却在指数期达到峰值。上述结果表明采用分子生态学技术能有效地监测产H2系统中混合菌群的优势种群及其动态演替规律。3.从暗发酵产H2系统中分离产H2功能菌。在解析暗发酵产H2系统中微生物演替规律的基础上,针对不同产H2阶段的优势菌设计分离方案。从运行8h的10LCSTR所采集的样品中分离纯化出08-2优势菌株,经16S rRNA基因序列鉴定,为蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）。从运行16 h的10 L CSTR所采集的样品中分离纯化出14株产H2菌菌株。并通过基于ERIC（肠杆菌基因间共有多重序列）-PCR技术将14株菌快速鉴别为3种不同的菌株。其中08-1菌株通过形态特征和分子生物学鉴定,初步鉴定为Clostridiumbeijerinckii。对该菌株的产H2性能进行研究,发现同葡萄糖相比,该菌株更适宜利用蔗糖、生物质木薯粉以及成分更为复杂的厨余垃圾生长及产H2。在间歇发酵中,实现最大产H2速率为245 mL H2/（L·h）,产H2量达到3.09 mol-H2/（mol-蔗糖）。而08-11菌株是能够产H2的兼性厌氧菌,与亲缘关系最近的地衣芽孢杆菌菌株（Bacillus lichenformisAnBa7）相似度为95%,因此,该菌株可初步判断为杆菌中的一个新种。对10L CSTR运行24 h阶段采集的样品用选择性培养基分离出能够快速生长并产H2的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）08-31。另外,从其他产H2系统中分离获得产H2菌株128株,通过ERIC-PCR及16S rRNA基因序列分析,获得丁酸梭菌5株,肠细菌属（Enterobacter）3株,产气荚膜梭菌,拜氏梭菌,地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌各1株。结果表明,从10 L CSTR反应器中成功分离出多株菌株,进一步证实了基于分子标记的监测系统预测菌群结构的有效性;另外,首次将ERIC-PCR技术成功地用于暗发酵产H2菌株的快速鉴别。4.分离与筛选光合产H2菌株。从不同废水中分离纯化出13株光合细菌,以30mM苹果酸为底物进行产H2能力研究,发现最大产H2速率为47-103 mL/（L·h）,底物转化效率为27.98-72.00%。从中挑出4株产H2能力较好的菌株,分别以乙酸和丁酸做碳源进行光发酵产H2试验,其中HL-1菌株能利用这两种碳源生长并产H2;SC-6和SC-7菌株不能利用这两种碳源产H2;HL-5菌株在乙酸培养基中能生长但不产气,在丁酸培养基中能生长并产H2。这些菌株的获得,对于研究光合细菌乙酸和丁酸代谢途径提供了极好的材料。另外,从37株光合细菌中筛选出一株能够利用甘油为碳源进行有效产H2的菌株。根据菌株的形态、生理生化特征、16S rDNA序列和ERIC-PCR结果分析,初步鉴定DB803菌株为Rhodobacter sphaeroides,同时也研究了DB803菌株在30℃,4000 lux光照厌氧条件下利用不同浓度的生物柴油生产废水产H2能力,当培养基中起始COD值为11.5g/L时,其在对数生长期平均产H2速度为38 mL/（L·h）,同时,废水COD去除率达91.2%,结果表明该菌株在生物柴油生产废水的处理及利用其进行生物产H2中具有潜在的应用价值。此外,不同的类球红细菌菌株利用甘油产H2能力的差异显著,筛选出的DB803菌株为进一步研究光合细菌利用甘油产H2的代谢途径提供了材料。5.优化光发酵产H2条件及初步研究自然光光发酵产H2。在光合产H2实验中,通过设置两种条件下制成的接种物和三种装液量,发现光照厌氧种子产H2性能优于黑暗好氧种子;反应器顶部空间小的其底物转化效率高;顶部空间填充氮气可能促进光合细菌菌体的代谢活性。另外,还研究了太阳光对6 L光发酵制氢系统的影响,在白天利用户外太阳辐射能晚上进行人工补光的产H2实验中,光合细菌的产H2速度与阳光光强成正比,白天和晚上的平均产H2速率分别为12.4 mL/（L·h）和9.0 mL/（L·h）,整个试验的底物转化效率达72.4%,与之对应的一次实验,即白天利用阳光晚上不补光的试验组,底物转化效率为45.02%。光反应器体积放大后,产H2时间的延长是径高比值大的柱状反应器其比表面积小所致。