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一、Toll样受体在多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞表达的研究目的明确Toll样受体(Toll-like Receptor ,TLR)在多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma ,MM)患者及正常健康志愿者骨髓单个核细胞(Bone Marrow mononuclear cells, BMMCs)中表达的差异,并初步探讨其对于MM细胞的可能作用。方法收集MM患者及正常健康志愿者的骨髓5-10ml,采用Ficoll梯度离心方法提取单个核细胞,Real-time PCR检测BMMCs中TLR1-10 mRNA表达的差异,流式细胞方法确认TLR蛋白表达水平。BMMCs体外培养同时加入相应TLR配体刺激,检测其中CD138阳性细胞的比例。采用CD138磁珠分选MM患者骨髓瘤细胞及正常健康志愿者骨髓浆细胞,RT-PCR方法检测TLR1-10 mRNA表达的差异。结果共收集29例初治MM患者及25例正常健康志愿者的骨髓,在BMMCs中Real-time PCR结果提示MM患者中TLR mRNA水平高于正常健康志愿者,其中TLR2,4和9有统计学意义。流式细胞检测结果提示在MM患者中TLR2,4和9蛋白表达水平高于正常健康志愿者,其中TLR4和9蛋白表达水平有统计学意义。分别使用TLR2,4和9配体(Pam3Csk4(1μg/ml), LPS(200ng/ml) and CpG DNA(1μg/ml))刺激体外培养的MM患者的BMMCs,可以观察到在LPS和CpG DNA刺激72小时后BMMCs中CD138阳性的细胞比例显著地增加。CD138磁珠分选5例MM患者MM细胞及3例正常健康志愿者中浆细胞,RT-PCR结果提示几乎所有的TLR的mRNA都可以在MM细胞中检测到,相反在正常健康志愿者浆细胞中仅能检测少数几种TLR的mRNA,主要为TLR1,5和9。结论TLR2, 4和9 mRNA表达水平在MM患者BMMCs中较正常健康志愿者显著增加。TLR4和TLR9的蛋白表达水平在MM患者BMMCs中也较正常健康志愿者显著增加。原代MM细胞中TLR mRNA表达显著高于正常浆细胞。TLR4及TLR9配体(LPS和CpG DNA)可能促进MM细胞的生长。二、LPS和CpG DNA对MM细胞增殖和凋亡影响和机制的研究目的初步探讨LPS和CpG DNA对MM细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法MTT方法检测Pam3Csk4,LPS和CpG DNA刺激后原代MM细胞,MM细胞系RPMI-8226以及XG-7细胞增殖水平。Annexin V抗体检测无血清培养状态下予LPS和CpG DNA刺激后原代MM细胞, RPMI-8226细胞以及XG-7细胞的凋亡。ELISA检测培养细胞上清中IL-6水平,IL-6中和性抗体封闭后,MTT方法检测原代MM细胞,RPMI-8226细胞和XG-7细胞的生长。结果LPS和CpG DNA刺激后原代MM细胞,RPMI-8226细胞以及XG-7细胞增殖水平较对照组以及Pam3Csk4组高。Pam3Csk4,LPS和CpG DNA并不能显著促进正常的浆细胞的增殖。在血清饥饿的情况下,原代MM细胞,RPMI-8226细胞以及XG-7细胞都表现出了一定比例的凋亡,Pam3Csk4刺激并不能显著的减少凋亡细胞的比例,而LPS和CpG DNA则可以显著地保护细胞凋亡。对于正常的浆细胞,则在Pam3Csk4,LPS和CpG DNA三组中,凋亡细胞的比例变化则不明显。ELISA检测LPS和CpG DNA刺激后的原代MM细胞,RPMI-8226细胞以及XG-7细胞上清中的IL-6,可以观察到LPS和CpG DNA可以显著的增强培养细胞上清中的IL-6水平。预先使用IL-6中和性抗体封闭,MTT法检测MM细胞的增殖,结果提示与正常IgG比较,IL-6中和性抗体可以降低TLR介导的MM细胞的增殖。结论LPS和CpG DNA可以显著地促进MM细胞的增殖,同时LPS和CpG DNA可以显著地保护MM细胞在血清饥饿诱导的凋亡。LPS和CpG DNA可以促进MM细胞上清中IL-6的分泌,并且预先加入中和性IL-6的抗体则可以阻断LPS和CpG DNA促进MM细胞增殖的作用。三、LPS和CpG DNA促进MM细胞生长相关信号通路的研究目的初步探讨LPS和CpG DNA对MM促进MM细胞生长可能依赖的信号通路。方法在相应的信号通路抑制剂存在下,MTT方法检测LPS和CpG DNA刺激后U266及RPMI-8226细胞增殖。Western方法检测相应的信号分子的激活。细胞核浆分离方法检测NF-KB P65亚基入核水平,MTT方法检测在NF-KB激活和抑制情况下U266及RPMI-8226细胞增殖,定量PCR检测在NF-KB激活和抑制情况下U266及R PMI-8226中IL-6的mRNA水平。结果JNK, P38和ERK激酶的抑制剂JNK-I(SP600125), PD169316和PD9805可以有效的抑制JNK, P38和ERK激酶的磷酸化水平。JNK-I(SP600125), PD169316和PD9805不能有效地阻断LPS和CpG DNA促进MM细胞增殖的作用。而IκBα-SR可以有效抑制NF-κB的激活,同时可以有效的抑制LPS和CpG DNA促进MM细胞增殖的作用。细胞核浆分离的结果表明在LPS和CpG DNA存在的情况下,NF-κB p65亚基入核水平显著的增加。进一步的研究表明在NF-κB信号通路激活的情况下,MM细胞的增殖表现为剂量依赖的增加,并且IL-6的mRNA也表现为剂量依赖的增加。相应地在NF-κB信号通路抑制的情况下,MM细胞的增殖以及IL-6的mRNA的水平都降低。结论LPS和CpG DNA促进骨髓瘤细胞生长并不依赖JNK以及MAPK通路,而主要依赖于NF-κB通路的激活。LPS和CpG DNA刺激可以促进MM细胞内NF-κB p65亚基入核。NF-κB的激活可以上调IL-6的mRNA的表达水平。