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近年来,中草药对机体免疫功能的调节作用越来越受到人们的关注,研究表明这种调节作用既有增强作用也有抑制作用,有些则有双向调节作用。通过研究这些中草药对机体免疫功能的调节作用,可能开发出具有临床应用价值的免疫调节剂。 地黄为玄参科(Scrophulariaceae)植物地黄 (Rehmannia glutinosa L.)的新鲜或干燥块根,是常用的一种传统补益类中药。生地黄为地黄的干燥块根,具有清热凉血,养阴生津之功效[1]。熟地黄为生地黄的加工炮制品,具有滋阴补血、益精填髓之功效。 近年来,国内外对地黄的化学成分、提取工艺、药理作用等进行了大量研究,研究发现地黄可以增强机体免疫功能。而古代文献记载以及现代临床上生地黄常被用于治疗风湿及类风湿关节炎(RA)等自身免疫性疾病。提示地黄既有免疫增强作用,又有免疫抑制作用,但是地黄发挥免疫增强和免疫抑制作用的物质基础及作用机制尚不明确。 因此,本实验室采用95%乙醇回流药渣水提法,分别得到生地黄和熟地黄的95%乙醇提取物、药渣水提物、粗多糖和药渣水提物去多糖部位。研究地黄发挥免疫调节作用的有效部位,并初步探讨其免疫调节作用机制,为地黄在临床上的应用提供理论依据。 上篇 生地黄提取物免疫调节作用实验研究 目的：初步探讨生地黄发挥免疫调节作用的物质基础及作用机制。 方法：体外实验中,常规分离Balb/c小鼠胸腺及脾的淋巴细胞,通过MTT法检测小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖,酶联免疫吸附法 (ELISA法) 检测小鼠胸腺、脾淋巴细胞上清液Th1细胞因子IL-2、IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-5的水平。体内实验中, Balb/c小鼠灌胃给药一周后,通过ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4的水平,采用流式细胞术检测小鼠胸腺、脾的 CD3+、CD19+、CD4+ 、CD8+ 、IFN-γ+ 、IL-4+细胞比例。 结果：体外实验结果显示,生地黄95%乙醇提取物(0.01、0.1、1 mg·mL-1)和药渣水提物去多糖部位(0.03、0.3、3 mg·mL-1)均可显著促进Con A刺激前后小鼠胸腺淋巴细胞增殖,提高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平；抑制脾淋巴细胞增殖,降低上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平,有剂量依赖性趋势。生地黄药渣水提部位(0.06、0.6、6 mg·mL-1)及其粗多糖部位(0.027、0.27、2.7 mg·mL-1)均可显著促进Con A刺激前后小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖,提高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平,有剂量依赖性趋势。其中生地黄粗多糖免疫增强作用强于药渣水提部位,95%乙醇提取物免疫抑制作用强于药渣水提物去多糖部位。 体内实验结果显示,小鼠灌胃给予生地黄不同提取物(原生药量 5、10、20 g·kg-1 ·day-1)一周后,95%乙醇提取物和药渣水提物去多糖部位均可显著降低血清IFN-γ的水平,提高血清IL-4的水平；生地黄药渣水提物和粗多糖组均可显著提高血清IFN-γ、IL-4的水平。 流式细胞术检测小鼠胸腺淋巴细胞及其亚群分布结果显示,生地黄不同提取物均可显著提高小鼠胸腺CD3+细胞比例,CD4+和CD8+细胞、IFN-γ+和IL-4+细胞比例,但是并不改变其比值。 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞及其亚群分布结果显示,生地黄 95%乙醇提取物和药渣水提物去多糖部位可降低小鼠脾CD3+细胞比例、提高CD19+细胞比例；可降低CD4+和CD8+细胞比例,但是并不改变其比值；可降低IFN-γ+细胞比例、提高IL-4+细胞比例。生地黄粗多糖可提高小鼠脾 CD3+细胞比例、降低 CD19+细胞比例；可提高CD4+细胞比例；可提高IFN-γ+和IL-4+细胞比例,但是并不改变其比值。 结论：生地黄提取物具有免疫调节作用,其中发挥免疫抑制作用的有效部位为生地黄 95%乙醇提取物和药渣水提物去多糖部位,根据目前实验室成分研究结果提示,有效成分可能为环烯醚萜苷类成分；发挥免疫增强作用的有效成分为粗多糖成分。免疫抑制作用机理可能通过降低外周T淋巴细胞及其亚群比例,降低Th1/Th2细胞比值,进而调节Th1和Th2细胞因子的表达；免疫增强作用机理可能通过提高外周T淋巴细胞及其亚群比例,但是并不改变淋巴细胞亚群比值,进而调节Th1和Th2细胞因子的表达。 生地黄提取物对胸腺淋巴细胞均具有一定的促进作用,有利于胸腺中T细胞分化、发育和成熟,作用机制可能通过提高胸腺中T淋巴细胞及其亚群比例,进而调节Th1、Th2细胞因子的表达。 下篇 熟地黄提取物体外免疫调节作用实验研究 目的：初步探讨熟地黄发挥免疫调节作用的有效部位及其免疫调节作用机制。 方法：常规分离Balb/c小鼠胸腺及脾的淋巴细胞,通过MTT法检测小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖,ELISA法检测小鼠胸腺、脾淋巴细胞上清液Th1细胞因子IL-2、IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-5的水平。 结果：体外实验结果显示,熟地黄95%乙醇提取物(0.015、0.15、1.5 mg·mL-1)和药渣水提物去多糖部位(0.014、0.14、1.4 mg·mL-1)可显著促进Con A刺激前后小鼠胸腺淋巴细胞增殖,提高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平；抑制脾淋巴细胞增殖,降低上清液IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的水平。熟地黄药渣水提物 (0.049、0.49、4.9 mg·mL-1)和粗多糖 (0.032、0.32、3.2 mg·mL-1) 均可显著促进Con A刺激前后小鼠胸腺及脾的淋巴细胞的增殖,提高上清液IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5水平,有剂量依赖性趋势。其中熟地黄粗多糖组增强作用强于药渣水提部位,熟地黄 95%乙醇提取物免疫抑制作用强于药渣水提物去多糖部位。 结论：熟地黄提取物具有免疫调节作用,其中发挥免疫抑制作用的有效部位为熟地黄 95%乙醇提取物和药渣水提物去多糖组,发挥免疫增强作用的有效部位为熟地黄药渣水提物中的粗多糖成分。免疫调节机理与其调节外周T淋巴细胞Th1和Th2细胞因子的表达有关。 熟地黄提取物均对胸腺细胞具有一定的促进作用,有利于胸腺中 T 细胞分化、发育和成熟。作用机制与其促进胸腺中T淋巴细胞Th1和Th2细胞因子的表达有关。 熟地黄发挥免疫调节作用的有效部位和作用机制与生地黄基本相同。但是熟地黄粗多糖部位免疫促进作用强于生地黄,而生地黄 95%乙醇提取物免疫抑制作用强于熟地黄。