论文部分内容阅读
小麦是世界上最重要的粮食作物之一,高产优质是小麦育种的重要目标。干旱是限制小麦生产的最严重的非生物胁迫因素,核氧还蛋白（Nucleoredoxin,NRX）与小麦的抗旱性相关;色泽是小麦面制品评价重要指标之一,脂肪氧化酶（Lipoxygenase,LOX）活性与小麦面制品品质密切相关。研究小麦抗旱和面制品色泽相关的基因,可为高产优质小麦新品种选育奠定基础。本研究选用干旱耐受型小麦品种晋麦47为材料,采用比较基因组学的方法,获得了普通小麦硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX）超家族新成员NRX基因TaNRX1的3个部分同源基因的cDNA（complementary DNA,cDNA）和gDNA（genomic DNA,gDNA）序列,对该基因编码蛋白的特征进行分析并明确基因的结构,进行响应干旱胁迫表达分析,预测启动子区域顺式作用元件,并构建植物过表达载体,为进一步基因功能解析奠定基础。利用SSR标记Xwmc312和STS标记LOX16和LOX18对180份宁夏小麦QLpx.cass-1AL和TaLOX-B1位点的TaLOX基因组成进行检测与分析,为宁夏小麦品质育种和生产提供理论依据。主要结果如下:1、小麦TaNRX1基因的克隆与序列分析。本研究采用比较基因组学的方法,获得了TaNRX1基因的3个部分同源基因的cDNA和gDNA序列。3个部分同源基因的cDNA序列的长度分别为1815 bp、1827 bp和1818 bp,开放阅读框（Opening Reading Frame,ORF）大小分别为1731 bp、1743 bp和1734 bp,分别编码576、580和577个氨基酸。序列比对结果表明,3个序列的ORF一致性为98.09%,编码的氨基酸序列一致性为97.93%。推断的氨基酸序列中含有3个TRX-like结构域和1个锌指结构,其中第1个和第3个结构域包含典型的WCG/PPC氧化还原活性位点,而第2个结构域是非典型的TRX-like结构域,属于Ⅰ型NRX。TaNRX1基因的编码蛋白生物信息学分析表明,该基因编码蛋白不具有典型的疏水区域和跨膜结构,不存在信号肽;其二级结构为α-螺旋、β-折叠、无规卷曲和扩展链,推测该蛋白为脂溶性稳定的非分泌蛋白。对TaNRX1基因的编码蛋白进行系统发育分析,显示该基因的编码蛋白与粗山羊草和大麦的亲缘关系最近,与雷蒙德式棉最远。TaNRX1基因的3个部分同源基因的gDNA序列（从ATG到TAG）长度分别为3946、4125和3903 bp,数据库比对结果表明它们位于小麦第2同源群染色体,并且利用中国春（Chinese Spring,CS）的缺体-四体系进行了验证,故该基因的3个部分同源基因分别被命名为TaNRX1-2A,TaNRX1-2B和TaNRX1-2D。对TaNRX1基因的cDNA与gDNA序列进行比对,发现其包含4个外显子和3个内含子,外显子的保守性高于内含子。2、模拟干旱胁迫下TaNRX1基因的表达分析和启动子区域顺式作用元件预测。本研究利用-0.5 MPa PEG-6000溶液（1/2 Hoagland’s营养液配制）对晋麦47的两叶期幼苗进行模拟干旱胁迫处理,分别在胁迫处理的不同时间点采集叶片,以正常处理的材料作为对照,进行实时荧光定量反转录PCR（Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR,qRT-PCR）分析。结果显示,TaNRX1基因的3个部分同源基因对干旱胁迫均有应答响应,呈现出相似的变化趋势,并具有2个峰值。利用数据库搜索TaNRX1基因的启动子序列,并利用生物信息学软件预测启动子区域的顺式作用元件,结果表明,TaNRX1基因的启动子区域存在响应脱落酸胁迫的元件ABRE和响应干旱胁迫的元件MBS等,但各种元件在3个部分同源基因的启动子中的数目不一致。3、TaNRX1-2D基因的分离与过表达载体的构建。根据AS-PCR的原理,结合TaNRX1基因的3个部分同源基因的cDNA序列比对结果,设计了D基因组的特异性引物,测序结果表明该基因为TaNRX1-2D。按照同源重组的策略,将表达载体PLGY-02与TaNRX1-2D基因整合,成功构建了TaNRX1-2D基因的过表达载体。4、宁夏小麦TaLOX基因的检测与分布分析。利用已有的分子标记检测宁夏小麦TaLOX基因在QLpx.caas-1AL和TaLOX-B1位点的组成情况,结果表明不同等位变异及其组合类型的分布比例不同。在QLpx.caas-1AL位点,发现了两种新的等位变异,根据其序列的长度分别命名为Xwmc312-199和Xwmc312-223;该位点五种等位变异的分布比例分别为46.11%、32.78%、18.89%、1.11%、1.11%。在TaLOX-B1位点存在2种等位变异,即TaLOX-B1a和TaLOX-B1b,各占15.56%和84.44%。宁夏小麦TaLOX基因存在8种等位变异组合类型,其中Xwmc312-227/TaLOX-B1b（40.56%）等位变异组合类型比例最高,Xwmc312-235/TaLOX-B1b（27.78%）次之,Xwmc312-199/TaLOX-B1b（1.11%）和Xwmc312-223/TaLOX-B1b（1.11%）最低。同时,在不同地区和相同地区不同来源品种（系）间,TaLOX基因的分布也存在差异。总体来看,宁夏小麦低活性的LOX基因等位变异组合类型(Xwmc312-227/TaLOX-B1b)的材料所占的比例明显高于高活性的LOX基因组合类型(Xwmc312-235/TaLOX-B1a)。