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前言
转移是恶性肿瘤的重要生物学行为之一,也是影响肿瘤患者预后并导致治疗失败的主要因素。转移是发生在肿瘤宿主内一系列复杂过程的最终结果,其中肿瘤侵袭细胞外基质是转移形成中多个步骤中最关键的一步,是转移的前奏[1,2]。建立能够模拟肿瘤侵袭力的检测分析方法对认识肿瘤侵袭转移机制,进行相关药物筛选具有重要意义。早期发展的检测侵袭力的方法主要利用含有基底膜的各种天然组织作为实验模型,在此基础上,Albini[1]等人将人工基质胶包被于带有微孔的膜上,构建了肿瘤细胞侵袭力分析的体外模型,称为勃顿小室法(Boydenchamber)或Transwell小室法。该模型是目前肿瘤细胞生物学研究和抗肿瘤药物筛选中应用最为广泛的方法,培养小室已被商品化。但该方法的检测过程包含多个手工操作步骤,易造成检测误差,难以准确定量细胞数量,同时也不适合对细胞侵袭行为进行动态观察和监测。
微流控芯片技术是一种新的微型分析系统,利用微加工技术可以在厘米大小的芯片上刻蚀出微米尺寸的反应管道,微型化的结构尺寸更利于模拟生物体内环境以进行细胞的相关分析,此外,微流控芯片还具有对多个分析过程进行自动化、集成化控制的优势,进而可以提高整个分析过程的准确性和速度。本研究拟建立基于微流控的肿瘤细胞侵袭力分析系统,定量评价细胞的侵袭能力,并与圣诞树形梯度发生器集成,利用二者形成的垂直方向和水平方向的双向梯度,进行抗肿瘤侵袭药物的筛选。
实验材料及方法
芯片的基本设计思想是在完成细胞侵袭力分析的同时实现相关药物的筛选。芯片结构包括供细胞侵袭力分析的三条基本通道即细胞通道、基质胶通道和条件培养基通道,以及供药物筛选的圣诞树型梯度发生器。通过流体控制在细胞通道-基质胶通道-条件培养基通道之间形成细胞迁移所需的垂直方向浓度梯度。通过与树状梯度生成器的连接可在细胞通道形成水平方向的药物浓度梯度用来进行抗侵袭药物筛选。
选用AZ-P4620正光刻胶软光刻法制作阳模,再将PDMS预聚物和固化剂以10:1(m/m)的比例混合均匀,浇灌在阳模上。抽真空30min除气,然后在85℃的烘箱中,固化30min,将PDMS从阳模板上剥离,等离子体处理后与玻璃进行封接,即可完成芯片制作。
对芯片进行一定处理后,在基质胶通道内注入胶原,37℃固化2小时后,真空除气通入不同的液体。首先对芯片内浓度梯度形成条件进行优化,即在树状梯度生成区的两个入口分别通入蓝色和红色染料,在条件培养基通道内注入透明水溶液,观察和记录芯片内梯度形成;在优化的梯度形成条件下进行细胞培养,取对数生长期的不同细胞,胰酶消化后调整细胞密度为1×106个/mL注入芯片细胞通道,在树状梯度生成区的两个入口均通入含10%血清培养基,在条件培养基通道内注入含10%血清的培养基,连续观察并记录细胞的生长状态;应用优化的芯片内细胞培养条件,进行细胞侵袭力的分析检测,即在树状梯度生成区两入口均通入无血清培养基,在条件培养基通道内注入含10%血清的培养基以形成垂直方向的梯度。连续观察细胞侵入基质胶的情况,并采用软件计算细胞侵袭面积及前导细胞迁移距离,定量评价细胞侵袭能力;为验证系统功能,在树状梯度生成区的两个入口分别通入含10%血清培养基和无血清培养基,在条件培养基通道内注入含10%血清的培养基,在树状梯度生成区域产生水平方向的0～10%的血清梯度,并与条件培养基通道内含10%血清的培养基形成垂直方向的梯度,观察细胞在双向血清梯度条件下的侵袭情况;取抗肿瘤药物十字胞碱,用无血清培养基配制成0.2μM浓度,将含有药物的培养基溶液和正常无血清培养基注入树状浓度梯度生成区域,在芯片内形成沿细胞通道方向分布的连续药物浓度梯度;取高侵袭性SGC-7901细胞和MDA-MB-231细胞注入细胞通道,在条件培养基通道内注入含10%血清的培养基,形成垂直方向的血清梯度,连续观察药物作用下,芯片水平方向不同位置细胞侵入基质胶的情况,并通过测量侵袭面积和前导细胞运动距离进行定量评价。
实验结果
一、芯片的制作与浓度梯度形成
采用光刻法成功制作PDMS芯片。优化芯片内浓度梯度形成条件,结果显示,在不同流速下考察芯片内的梯度形成状况。在Q=3μL/hr流速下,能够快速形成实验所需的双向浓度梯度,且能够长时间稳定维持。
二、芯片内的细胞培养
实验采用多种细胞系进行长时间培养,结果表明包括正常和肿瘤细胞的多种不同细胞在芯片内均能正常生长并增殖。证实了芯片的细胞培养能力。
三、芯片内的细胞侵袭力检测及定量分析
采用具有不同侵袭能力细胞系进行芯片侵袭力检测,分别为无侵袭性的人胚肾细胞系HEK-293、中低侵袭性肠癌细胞系SW-480、中低侵袭性乳腺癌细胞系MCF-7、中侵袭性宫颈癌细胞系HeLa、高侵袭性胃癌细胞系SGC-7901。结果显示,肿瘤细胞均不同程度进入基质胶通道,其中高侵袭胃癌细胞系SGC-7901运动现象最为明显,甚至有细胞进入到条件培养基通道,中低侵袭细胞系运动进入基质胶通道但并未进入条件培养基通道,且不同细胞系之间存在一定差别。通过连续的观察,可以看到各种具有不同侵袭能力的细胞系每天的运动变化情况。证实了该芯片系统能够应用于不同细胞的侵袭运动检测以及同种细胞在不同作用下的运动变化检测。
实验结果通过测量侵袭面积和前导细胞侵袭距离的方法进行了定量分析。两种方法的分析结果基本一致,能够显示出高、中、低侵袭性细胞系之间的差异。
四、采用芯片系统进行抗侵袭药物的筛选
为了对系统功能性进行检测考查系统是否可以形成垂直方向和水平方向的双向血清梯度,实验使用高侵袭细胞系SGC-7901细胞作为模式细胞。在细胞通道内使用无血清和含10%血清的培养基形成水平方向的浓度梯度,并与条件培养基通道内的含10%的培养基形成垂直方向的浓度梯度。实验结果显示,沿芯片水平方向侵入基质胶通道的细胞逐渐减少,说明该系统在水平方向及垂直方向均可形成功能性梯度。
药物筛选实验部分,选用0～0.2μM十字胞碱药物梯度分别作用SGC-7901细胞和MDA-MB-231细胞。对SGC-7901细胞结果进行分析,显示随着药物浓度的增加,细胞的侵袭运动受到不同程度的抑制,且该抑制作用与药物的浓度呈现正相关,并表现出明显的药物浓度依赖性,即该系统可定量筛选和评价药物的抗侵袭能力。对MDA-MB-231细胞的作用结果同样可以检测出随药物浓度的增加细胞的侵袭逐渐受到抑制,此外,通过荧光染色可同时观察到药物具有的诱导凋亡作用。
结论
本研究建立了基于微流控的肿瘤细胞侵袭力分析系统,实现了对不同侵袭能力肿瘤细胞的定量分析:通过建立双向、连续浓度梯度形成系统,首次在芯片上初步实现了对抗肿瘤侵袭药物的筛选,可望为肿瘤转移机制的研究及相关药物筛选提供新的分析平台。