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生殖细胞的发生是发育生物学研究的主要内容之一,同时也是一个复杂的发育调控并涉及时空的多基因活动过程。其中原始生殖细胞起源、迁徙、分化等方面的研究,是备受关注的生物学研究方向。与其他模式生物相比,十足目动物关于生殖发育的分子机制方面的研究相对薄弱。因此,鉴定和发现十足目生殖相关的基因并探索其功能,具有重要意义和潜在的应用价值。本文以中华绒螯蟹为研究对象,通过现有研究和相关文献的查阅,对与中华绒螯蟹生殖发育有着密切联系的vasa、piwi、nanos、PL10基因进行研究。研究主要分为四个部分:1、中华绒螯蟹vasa基因的表达分析及表达模式研究vasa基因是生殖质的主要组成成分之一,且在生殖腺中特异性表达,常可作为示踪生殖腺形成的分子标记。本文采用实时荧光定量PCR技术对vasa基因在中华绒螯蟹胚胎及幼体发育阶段的表达情况进行了研究,研究发现,vasa m RNA在胚胎发育时期表达量相对幼体发育阶段表达量要高,推测vasa m RNA可能主要作用于胚胎发育阶段。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明,vasa m RNA在精母细胞中分布于染色质中,在精子细胞中主要分布于核杯,在卵母细胞中定位于细胞质。整胚原位杂交发现,胚胎和幼体发育时期vasa m RNA表达集中分布,可根据vasa m RNA的分布初步推断中华绒螯蟹的性腺生成轨迹。2、中华绒螯蟹piwi基因克隆及表达研究Piwi基因在果蝇中有维持生殖干细胞和调节细胞分裂的功能,甲壳类中对此基因的研究非常少。本文采用SMARTTM RACE技术,克隆了piwi基因全长序列。piwi基因的c DNA全长3253bp(Gen Bank注册号:KR061909),5’UTR 26bp,3’UTR179bp,开放阅读框ORF2868bp,编码955个氨基酸。多序列比对和同源性分析表明中华绒螯蟹的piwi基因和三疣梭子蟹的piwi基因同源性为70%。跨模区分析表明PIWI蛋白为亲水性蛋白结构。通过实时荧光定量PCR分析表明,piwi m RNA在血液、肌肉、心脏、胸神经节、鳃、肝胰腺、肠、卵巢、精巢中均有表达。但是在性腺中的表达要明显高于其他各组织,随着精巢的发育变化,piwi m RNA的表达量逐渐减少,在精母细胞时期表达量最高;同样在卵巢中piwi m RNA也随着卵巢的发育而发生波动,在卵母细胞期表达量最高。在胚胎和幼体发育阶段,大眼幼体期表达量最高。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明,piwi m RNA在精母细胞中分布于染色质中,在精子细胞中主要分布于核杯中,在卵母细胞中定位于细胞质。整胚原位杂交发现,以piwi m RNA阳性信号指示的生殖腺原基在心跳期已比较明显,溞状幼体I期时分布于头胸甲与腹部交接处,随着发育逐渐集中于头胸甲背部,至溞状幼体II期时已向头胸甲迁移,溞状幼体III期时更加集中,完全位于头胸甲的背面的一个区域。3、中华绒螯蟹nanos基因克隆及表达研究nanos m RNA和vasa m RNA是性腺的最初成分P颗粒中的2个最重要的组成成分。本文采用SMARTTM RACE技术,克隆了中华绒螯蟹nanos基因,nanos基因c DNA序列全长2886bp(Gen Bank注册号:KR061910),5’UTR 59bp,3’UTR1543bp,开放阅读框ORF1284bp,编码427个氨基酸。跨膜区分析表明NANOS蛋白为亲水性蛋白结构。实时荧光定量PCR分析表明,nanos m RNA在血液、肌肉、心脏、胸神经节、鳃、肝胰腺、肠、卵巢、精巢中均有表达,其中在血液中表达量最低,在性腺中表达量最高,且精巢中表达量高于卵巢。卵巢中nanos基因在卵巢发育的大生长期(对数生长期)早期达到峰值,随着卵巢发育趋向成熟,有下降趋于平缓的趋势;在精巢发育过程中,在7月份的精母细胞期表达量最高,后逐渐降低,至精子发生早期又急剧升高,形成精子后迅速下降。在胚胎和幼体发育时期,在大眼幼体期的表达量最高,与其他各期差异极为显著。对精巢和卵巢的原位杂交结果表明,nanos m RNA在精母细胞中分布于染色质中,在精子细胞中主要分布于核杯中,在卵母细胞中定位于细胞质。整胚原位杂交发现,以nanos m RNA阳性信号指示的生殖腺原基在出膜前期比较明显,溞状幼体I期时nanos阳性信号分布于头胸甲与腹部交接处,随着发育逐渐集中于头胸甲背部,至溞状幼体II期时已完全分布于头胸甲,溞状幼体III期时更加集中,完全位于头胸甲的背面的一个区域。4、中华绒螯蟹PL10基因克隆及表达研究PL10基因是vasa的祖先基因。本实验克隆得到的中华绒螯蟹PL10基因片段序列长1671bp(Genbank注册号:KR061911),编码566个氨基酸。多序列比对和同源性分析表明中华绒螯蟹的PL10基因和秀丽白虾、日本沼虾、中国明对虾同源性分别为85%、84%、84%。系统进化分析证明了PL10基因在进化上高度保守。实时荧光定量PCR分析表明,PL10 m RNA在各组织中均有表达,但表达量差异较大,血液、神经节、鳃组织中低量表达,肝胰腺、精巢、卵巢中高量表达。对中华绒螯蟹各发育阶段性腺中PL10 m RNA的实时荧光定量PCR实验表明,在12月份的精子形成期达到高峰,说明PL10基因参与了精子的发生;在卵巢中PL10m RNA的表达在对数增长前期有小幅上升,对数生长期后则呈下降趋势。实时荧光定量PCR实验表明,PL10基因在胚胎中的表达量高于幼体阶段。研究发现,在胚胎发育各期及溞状幼体阶段,vasa和nanos的表达模式相似,说明在此过程中两者功能相近;PL10基因在胚胎发育的早期阶段的表达量要高于vasa和nanos,说明PL10的功能与vasa和nanos不尽一致。通过以上的研究和分析,中华绒螯蟹生殖相关基因piwi、nanos和PL10基因c DNA序列的获得,丰富了中华绒螯蟹遗传学资源,可为解决中华绒螯蟹养殖过程中的性早熟、个体规格不统一现象提供基础资料,具有一定意义。与其他模式动物相比,甲壳动物生殖生理的分子机制研究相对薄弱,本实验对于中华绒螯蟹生殖相关基因的研究,可望为中华绒螯蟹的遗传育种改良提供相应的理论依据。