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目的:Micro RNAs(mi RNAs)在绝大部分癌症中的表达都有所失调,例如原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),但失调的确切机制尚有待研究。我们课题组在前期研究中已经发现,与正常肝细胞相比,肝癌细胞更易对内质网应激诱导的细胞凋亡(endoplasmic reticulum stress,ERS)产生抵抗,但对于mi RNAs与内质网应激诱导的凋亡抵抗(也称应激性凋亡抵抗)的相互调控机制却知之甚少。我们利用mi RNAs芯片技术,对内质网应激前后的Hep G2细胞进行mi RNAs表达谱分析,结果发现,mi R-663的表达水平发生显著上调。同时,生物信息学分析也表明了mi R-663与内质网应激和许多肿瘤的增殖、凋亡等生物学行为有着一定的相关性。本研究在此基础上,利用q RT-PCR技术进一步验证mi R-663的表达水平在内质网应激后的肝癌细胞系中的是否会上调,同时通过mi R-663模拟物(mi R-663mimics)和mi R-663阻遏物(mi R-663 inhibitors)来转染肝癌Hep G2细胞,观察mi R-663对内质网应激状态下的Hep G2细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨mi R-663在肝癌细胞耐受内质网应激诱导的细胞凋亡中的作用。随后我们又应用了靶基因预测分析软件,进一步探索mi R-663影响肝癌细胞凋亡的下游靶基因,为阐明肝癌细胞应激性凋亡抵抗的分子机制带来新的契机,也将为肝癌药物治疗寻找新的作用靶点奠定理论基础。方法:1.以3μM的衣霉素(tunicamycin,TM)处理人肝癌Hep G2细胞株诱导内质网应激,利用mi RNAs芯片技术检测未经TM处理及TM处理后mi RNAs的表达变化,对人肝癌Hep G2细胞株内mi RNAs表达谱分析。2.以3μM的衣霉素(tunicamycin,TM)处理人肝癌细胞株(Hep G2、Be L7402和SMMC7721细胞),诱导内质网应激,利用q RT-PCR技术检测未经TM处理及TM处理24 h后,人肝癌细胞株内mi R-663表达水平的差异。3.应用Lipofectamine RNAi MAX将与mi R-663 mimics,mi R-663 inhibitors转染入Hep G2细胞中。转染24 h后,运用q RT-PCR技术测定转染后mi R-663表达水平的变化。4.应用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测上调或下调mi R-663的表达水平对内质网应激状态下的Hep G2细胞增殖的影响。5.应用FCM(Flow Cytometry,流式细胞术),Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测下调mi R-663的表达水平对Hep G2细胞凋亡率的影响。6.应用靶基因预测软件分析的mi R-663的靶基因。7.应用qRT-PCR和ELISA技术(酶联免疫吸附试验)检测上调或下调mi R-663的表达对靶基因TGFB1表达水平的影响,内质网应激前后TGFB1表达水平的变化以及转染TGFB1 si RNA后TGFB1表达水平的变化。8.应用FCM(Flow Cytometry,流式细胞术),Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测下调TGFB1的表达水平对Hep G2细胞凋亡率的影响。结果:1.Mi RNAs芯片结果显示,对衣霉素处理前后的70条mi RNAs进行比较分析,mi R-663在衣霉素处理后上调最明显,尤其在衣霉素处理24 h后。2.q RT-PCR结果显示,衣霉素处理24 h后,mi R-663在Hep G2、Be L7402和SMMC7721细胞内表达均上调,其表达水平分别为未处理组的(1.93±0.16)倍、(1.88±0.24)倍和(2.15±0.21)倍。3.qRT-PCR结果显示,转染HepG2细胞24 h后,mi R-663 mimics组细胞内mi R-663的表达水平显著升高,其相对表达量约为阴性对照组的(1128.68±74.16)倍,而mi R-663 inhibitors组细胞内mi R-663的表达水平显著降低,其相对表达量约为阴性对照组的(0.27±0.13)倍。4.CCK-8结果显示,衣霉素及mi R-663 inhibitors联合处理组与衣霉素单独处理组相比,Hep G2细胞的增殖率发生了显著降低;而衣霉素及mi R-663 mimics联合处理组与衣霉素单独处理组相比,Hep G2细胞的增殖率出现了显著上升。5.FCM结果显示,衣霉素及mi R-663 inhibitors联合处理组的Hep G2细胞凋亡率显著高于衣霉素单独处理组。6.靶基因分析预测结果显示,转化生长因子β-1(transforming growth factor beta 1,TGFB1)是mi R-663的靶基因。7.qRT-PCR和ELISA结果显示,转染mi R-663 mimics使mi R-663表达水平升高时,TGFB1在m RNA和蛋白质水平的表达均降低;转染mi R-663 inhibitors使mi R-663表达水平降低时,TGFB1在m RNA和蛋白质水平的表达均升高;衣霉素处理Hep G2细胞24 h后,TGFB1在m RNA和蛋白质水平均发生了显著下调;转染TGFB1 si RNA后TGFB1在m RNA和蛋白质水平均明显下调。8.FCM结果显示,转染TGFB1 si RNA使TGFB1表达下调后,Hep G2细胞凋亡率显著低于对照组。结论:1.肝癌细胞在内质网应激状态下mi R-663表达上调。2.转染mi R-663 mimics和mi R-663 inhibitors能有效地上调和下调mi R-663的表达。3.下调mi R-663的表达能够促进内质网应激状态下肝癌细胞凋亡,抑制细胞增殖。4.肝癌细胞在内质网应激状态下TGFB1表达下调。5.上调mi R-663能抑制TGFB1m RNA和TGFB1蛋白的表达,下调mi R-663能促进TGFB1m RNA和TGFB1蛋白的表达,TGFB1可能是mi R-663的直接靶基因。6.干扰TGFB1 m RNA的表达可抑制肝癌细胞的凋亡。7.Mi R-663可能通过下调TGFB1蛋白的表达,抑制肝癌细胞凋亡。