论文部分内容阅读
目的：多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是以骨髓中恶性浆细胞增生并伴有广泛溶骨病变为特征的B细胞系的恶性肿瘤，大约占人体恶性肿瘤的1％-2％。近年来发病有逐年增加的趋势。尽管新治疗手段如硼替佐米、沙利度胺及其衍生物的应用乃至造血干细胞移植用于治疗MM，但其仍难以治愈。因此探索可能的发病机制，从而寻找更多治疗的靶点，具有非常重要的意义。近年来对MM发病机制的研究中，细胞因子在MM的发生发展中的作用已广为重视，做为本病的重要细胞因子-B淋巴细胞刺激因子（B Lymphocyte Stimulator，BLys）的研究在国内尚未见报道。本研究通过观察Blys在多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖中的作用，探索多发性骨髓瘤的发病机制，为多发性骨髓瘤患者的临床靶向治疗提供理论基础和实验数据。
方法：
1.细胞培养和传代
人类多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226，培养于体积分数为20％灭活胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中。置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每48-72小时传代一次，实验采用对数生长期细胞，胎盘蓝染色拒染率均在95％以上。
2.MTT法检测BLys对RPMI8226细胞生长的影响
2.1 rHuBLyS对RPMI8226细胞的增殖实验
取对数生长期的RPMI8226细胞悬液，随机分成阴性对照组、不同剂量BlyS组。阴性对照组加入100μl细胞培养液，不同浓度的BlyS组终浓度分别为0.1、0.5、1.0、3.0、5.0μl/ml，每组3个平行孔。37℃、5％CO2的培养箱中培养，分别于24、48、72小时之后，每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，37℃孵育4h，然后离心培养板，小心吸去上清，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡器充分振荡后于酶标仪570nm处测各孔吸光度值。
2.2 BlyS拮抗硼替佐米作用的实验
取对数生长期的RPMI8226细胞悬液，随机分成实验组和对照组，对照组加入100μl细胞培养液，实验组第1组加入100μl BlyS溶液使终浓度达到2.0μg/ml；第2组加入硼替佐米使终浓度达10μg/ml；第3组加入BlyS溶液+硼替佐米终浓度分别为2.0μg/ml、10μg/ml。每组3个平行孔，48小时后以上述同样的MTT法测量各孔的光吸收值。
3.流式细胞术检测BLys对RPMI8226细胞细胞凋亡的影响
取对数生长期的RPMI8226细胞1×105/ml，以不同浓度BLys处理48h后，收集细胞，用预冷4℃PBS洗三遍后，加入碘化丙碇（PI：50mg/ml，Triton-X1001.0％）1ml，4℃避光反应30分钟，用流式细胞仪应用Muticycle AV分析软件测定细胞周期和细胞凋亡率。
4.流式细胞术检测不同浓度BLys作用RPMI8226细胞后NF-κB（p65）的蛋白表达情况
取对数生长期的RPMI8226细胞1×106/ml，加入BLys培养48小时后，收集细胞，PBS洗三遍，加入NF-κB（p65）抗体，室温静置1个小时，再加入二抗，通过流式细胞仪应用Muticycle AV分析NF-κB（p65）的蛋白表达情况。
5.western免疫印迹（western blot）的方法检测不同浓度BLys组别c-jun、p-p38的蛋白表达水平
取对数生长期的RPMI8226细胞1×106/ml，加入浓度分别为0.5μg/ml、2.0μg/ml BLys培养48小时后分别提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝标准曲线法（Bradford法）定量。以β-actin作为内参照，应用western blot方法检测不同组别c-iun、p-p38的蛋白表达水平。
结果：
1.BLys促进多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖，在一定浓度范围内呈时间剂量依赖关系。BLys浓度为0.1、0.5、1.0、3.0、5.0μg/ml时，24小时的细胞增殖率分别为（72.79±10.54）％、（113.95±12.16）％、（136.82±11.8）％、（162.25±14.27）％、（182.06±13.08）％；48小时的细胞增殖率分别为（212.78±6.94）％、（255.75±11.34）％、（359.65±25.5）％、（480.53±17.32）％、（594.89±19.35）％；72小时的细胞增殖率分别为（407.72±15.56）％、（612.36±22.91）％、（928.55±34.10）％、（1194.64±45.17）％、（1510.82±56.08）％。对照组三个时间点的增值率分别为：（41.64±7.63）％、（90.96±7.36）％、（270.36±10.27）％。
2.rHuBLyS拮抗硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的抑制作用。仅加入硼替佐米组、加入硼替佐米+BLys组，共同培养48小时后细胞的吸光度值分别为0.134±0.005、0.239±0.013。仅加入BLys组的吸光度值为1.247±0.007。
3.rHuBLyS促进多发性骨髓瘤细胞RPMI8226更多的进入S期，BLys浓度为0、0.5、1.0、2.0μg/ml时，培养48小时后，S期细胞所占比例分别为26.7±3.65％、30.2±5.55％、34.53±1.20％、46.3±3.18％。
4.BLys可上调RPMI8226细胞内NF-κB（p65）的蛋白表达，不同浓度BLys作用48小时后，NF-κB（p65）的蛋白表达率由（X-Mode）26.6上升至43.2。
5.随着BLys浓度的加大，在一定范围内下调RPMI8226细胞内p-p38的蛋白表达水平，同时抑制c-jun蛋白的表达水平。
结论：
1.在一定浓度范围内，BLys促进人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖，且呈时间、浓度依赖性。
2.rHuBLyS拮抗硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的抑制作用。
3.rHuBLyS促进多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的增殖其机制与上调NF-KB蛋白，抑制c-jun、p-p38蛋白的表达有关。