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滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis(Franch.) Hand-Mazz.为延龄草科Trilliaceae重楼属ParisL.下多叶重楼Paris polyphylla Smith的变种,分布于云南高原及周边地区,是《中华人民共和国药典》(2010)重楼药材的基源植物之一,为“云南白药”、“宫血宁”等多种中成药的主要原料。本研究从滇重楼的文献考证、分布、生境及资源调查着手,从表型、染色体及DNA分子水平对滇重楼生物资源进行研究,注重居群生物学和生态学习性调查,居群遗传多样性分析,辅以矿质元素分析、主要次生代谢产物分析,对滇重楼生物资源进行评价,为滇重楼资源的合理利用和保护提供基础资料。
1资源调查显示,滇重楼的分布区域范围急剧缩小,资源蕴藏量急剧减少,居群数量和分布面积不断萎缩,破碎化严重,居群年龄结构趋于幼龄化,居群数量呈衰减趋势。由于人为过度采挖和生境破坏严重,加之生长缓慢和繁殖率低,是导致滇重楼濒危的主要原因。
滇重楼分布生境多样化,生态幅跨度大。光照和温度是影响其生长的重要因子,生境土壤中可吸收N、P、K含量普遍偏低,可能导致其生长缓慢。
近年来,滇重楼人工种植发展迅猛,但种植水平差异较大,种植技术缺乏,种植周期长,原因在于对滇重楼生物学和生态学习性知之甚少。
2对不同生态地理来源的43个滇重楼居群在昆明小哨同地引种试验表明,不同滇重楼居群间物候期差异明显,不同居群的出苗期与原生地的雨季来临时间有关,倒苗期和生长期长短与原生地的年均气温有关,充分体现了滇重楼对水分与温度等环境因子的生态适应性。
相关性分析显示,植株高大、叶片较大、多茎,且年生长期较长的居群,具有较快的生长速度和较大的经济产量,来自滇东南地区及黔西地区的植株明显要比其它地区要大,其株高、叶长、叶宽等性状较其他地区要高,在优良种源筛选时,可以作为快速生长的优良种源。
表型变异分析显示,生境破坏较少的居群表型变异系数较大,表型多样性丰富,滇西北地区在地区水平和居群水平的表型变异以及表型多样性指数在5个地区中均最高,是滇重楼表型变异最丰富的地区。
表型方差分析显示,就滇重楼整体而言,各性状平均表型方差分化系数为56.73%,居群间稍大于居群内。不同地区间滇重楼表型差异不明显,但在地区内居群间的表型分化较大,为滇南及滇西南56.12%>滇西北44.61%>滇东南38.22%>滇东及黔西36.77%>滇中地区35.7%,表明滇南、滇西南滇重楼居群间的表型分化明显。
不同年份生长调查显示,不同生态地理来源的滇重楼居群对不同年份的气候变化的适应性分化明显,PL16、PL80和PL83居群的年度间表型性状不稳定,居群的表型可塑性强,生态适应性强;PL25、PL27和PL88居群表型性状较稳定,滇重楼居群不同性状对不同年份的气候变化的适应性有所不同,株高等性状年度间的差异较大,叶片数等性状年度间的差异则较小。
3对15个滇重楼居群及6个其他重楼居群的核型分析显示,滇重楼的染色体结构复杂多样,居群内个体间的染色体变异较大,而居群间的差异相对较小。滇重楼居群核型多态性丰富,每个居群中至少有2种核型,除了6m+4t为基本核型外,还有6m+2t+2st和6m+1t+3st等其它核型。B染色体在滇重楼中出现较为频繁,约73.3%的居群有B染色体;统计发现,随着B染色体数目的增多,其出现频率减少。
4对35个滇重楼居群的EST-SSR标记研究表明,滇重楼总体上遗传多样性丰富,等位基因数A为1.9955,Neis基因多样性H为0.1811,Shannon指数I为0.3075;滇重楼居群水平,单个居群的遗传多样性不高,等位基因数A平均为1.3171,Neis基因多样性H平均为0.0938,Shannon指数I平均为0.1452,一般来自生态环境较好、资源破坏较少区域的居群遗传多样性相对较高。
滇重楼居群间的基因分化系数Gst为0.4938,基因流为Nm0.5126,表明资源破坏严重及生境片段化使滇重楼居群间基因流受阻,居群间遗传分化加大。遗传关系及聚类分析显示,滇中地区与其他地区的滇重楼均有较近的遗传关系。
5矿质元素检测显示,34个滇重楼居群根茎内不同元素含量的分布式样为,Ca>K> Mg>Fe>Na>Cu>Mn>Zn>Cr。滇重楼居群之间、不同分布地区之间,还是滇重楼与近缘种之间,植株的矿质元素含量差异较大,并未出现明显的规律性; K和Mg等限制元素在重楼植物体内的含量相对稳定。
6建立了对46个滇重楼及其他重楼居群的紫外光谱指纹图谱,并通过SIMCA软件PCA与PLS分析,能够将不同地理来源的滇重楼居群区分开来,也可以将滇重楼与其他重楼区分开来。
双指标序列多维分析表明,滇重楼的共有峰率在36.00%-77.78%之间,平均共有峰率为53.25%,相同地区内滇重楼居群平均共有峰率分别为:滇中地区为51.69%;滇南及滇西南地区为55.23%;滇东南为52.8%;滇西北为54.24%;滇东及黔西为54.63%,研究显示,地理距离近、环境相似的居群具有较高的共有峰率,居群间化学成分相似程度高。
7高效液相色谱法检测显示,32个滇重楼居群的重楼总皂苷平均含量为1.462%,有71.9%的滇重楼居群达到药典标准,不同分布区滇重楼的重楼总皂苷含量的为:滇南及滇西南(1.738%)>滇东南(1.07%)>滇东及黔西(1.059%)>滇中(0.865%)>滇西北(0.794%),并呈现出遗传多样性丰富的地区,重楼皂苷的变异系数大,皂苷的组分差异较大。
滇重楼及多叶重楼其他变种居群重楼总皂苷分别平均为,长药隔重楼(3.334%)>七叶一枝花(1.931%)>滇重楼(1.462%)>多叶重楼原变种(1.454%)>白花重楼(1.219%),多叶重楼其他变种居群重楼总皂苷含量均达到国家药典标准。