【摘 要】
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猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪呼吸系统传染病,急性发病时死亡率高,传染性强,给全世界养猪业造成了重大经济损失。疫苗防治仍然是预防该病的重要手段,也能减少抗生素的使用从而降低耐药性的产生。APP分泌的ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ毒素属于脂酰化蛋白质,同时是APP最主要的毒力因子和保护性抗原。本实验室已将三种重组的
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猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪呼吸系统传染病,急性发病时死亡率高,传染性强,给全世界养猪业造成了重大经济损失。疫苗防治仍然是预防该病的重要手段,也能减少抗生素的使用从而降低耐药性的产生。APP分泌的ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ毒素属于脂酰化蛋白质,同时是APP最主要的毒力因子和保护性抗原。本实验室已将三种重组的非脂酰化Apx毒素蛋白(rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA)与灭活的血清1型APP菌体抗原混合,制备出“猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗”,免疫猪产了生良好的多血清型交叉免疫保护力,且无明显副反应。本研究通过建立针对rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的三种ELISA抗体检测方法,进行猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗的免疫试验,测定了其免疫后的抗体消长规律,为评价该疫苗的免疫效果及免疫程序的制定提供科学依据。主要研究结果如下:1.rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA间接ELISA方法的建立将实验室保存的重组质粒pQE-ApxⅠA、pQE-ApxⅡA和pQE-ApxⅢA分别转化入大肠杆菌M15感受态细胞,诱导表达了rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA重组蛋白,用纯化后的重组蛋白分别建立三种ELISA抗体检测方法,并进行了条件优化,重复性较好。rApxⅠA间接ELISA检测方法中,rApxⅠA抗原包被浓度22.57μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释40倍,37℃孵育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min。在最佳反应条件下,阴阳临界值为0.267。rApxⅡA抗原包被浓度为39.88μg/m L,4℃过夜包被;1%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍后37℃温育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光室温显色30min;阴阳临界值为0.447的间接ELISA检测方法。rApxⅢA间接ELISA检测方法中,抗原稀释到11.10μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍,37℃孵育30min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min;阴阳临界值为0.283。2.疫苗抗体消长规律的测定在猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫试验中,共购入9头50日龄仔猪,3头为空白对照组、6头为疫苗组,分别耳后肌肉注射本实验室制备的PBS对照和亚单位-灭活菌苗,免疫后28天加强免疫一次。首免后0、14、21、28、60、68、75、82、89、96、110天前腔静脉采血分离血清。ELISA检测结果显示,疫苗组免疫后rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体变化趋势基本一致:首免0天至28天的变化不明显,二次免疫后显著上升,疫苗组rApxⅠ抗体在首免后75天达到峰值(效价230倍),rApxⅡ抗体在首免后60天达到峰值(效价483倍),rApxⅢ抗体在首免后68天达到峰值(效价73倍),而后抗体水平逐渐下降。一免后110天rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体仍维持在较高水平。本研究建立了三种间接ELISA抗体效价检测方法,重复性较好。猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫后的抗体消长规律表明该疫苗能刺激机体产生rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA的特异性抗体,建议50日龄首免,首免后28天进行二免为宜。
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