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胰岛素样生长因子系统(Insulin-like Growth Factor system, IGF system)是一类进化上比较保守的信号通路。该系统参与调控细胞的存活、分化、迁移以及增殖,同时对个体的生长、发育、成熟和代谢都具有重要作用。在哺乳动物中,胰岛素样生长因子系统由2个配体(IGF1, IGF2)、2个受体(IGF1R, IGF2R)、6个结合蛋白(IGFBP1-6)组成。众所周知,配体需要与受体结合才能发挥相应的生物学功能；结合蛋白则通过内分泌、旁分泌或者自分泌的方式延长配体生活周期调节配体的生物学功能。近年来,本实验室在硬骨鱼类克隆了胰岛素样生长因子家族的一个新成员——IGF3(Insulin-like growth factor3),它仅在性腺表达。初步研究表明IGF3可能在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)性腺分化、发育、成熟和生殖周期中具有重要作用。本研究拟通过转基因过表达IGF3来初步研究其在性腺发育过程中的生物学功能,并对性腺中表达的IGFBP进行系统研究,以期寻找IGF3相应的结合蛋白。构建转基因过表达载体pIRES-hrGFP-1a-IGF3,显微注射1细胞时期的XX基因型受精卵。待孵化后120天提取83条转基因鱼基因组DNA并用pIRES-hrGFP-1a载体特异性引物筛选出6条阳性转基因鱼,阳性率为7.2%。荧光体式显微镜下观察到性腺表达的绿色荧光蛋白,通过组织学(HE染色)观察性腺看到类似颗粒细胞样的体细胞大量增生,同时伴随有同步化分裂现象。目前在哺乳动物中只有6个IGFBP,而硬骨鱼类由于发生了一次特有的基因组复制,所以IGFBP基因家族应该是12个。但实际上本研究从尼罗罗非鱼中只得到11个IGFBP,分别命名为IGFBP1a、IGFBP1b、IGFBP2a、IGFBP2b、IGFBP3a、 IGFBP3b、IGFBP4、IGFBP5a、IGFBP5b、IGFBP6a、IGFBP6b。系统进化分析表明：硬骨鱼类中只存在一个IGFBP4,这可能是由于进化过程中复制基因发生了次生性丢失；基因编码序列分析发现,所有IGFBP均是由四个外显子组成。IGFBPs成熟肽序列均由三个结构域组成：保守的N-、C-结构域以及不保守的L结构域。通过RT-PCR对8月龄尼罗罗非鱼IGFBPs进行组织表达模式发现IGFBP2a、IGFBP3a、IGFBP3b、IGFBP4、IGFBP5a和IGFBP5b均在性腺中有表达。同时采用Real-Time PCR对IGFBPs (2a、3a、3b、4、5a、5b)进行性腺发育过程中(孵化后5天到70天)表达分析发现：IGF3和IGFBP3b、IGFBP5a的表达模式相似；在孵化后10天的IGFBP2a,孵化后20天的IGFBP2a、3a、4表达存在明显的性别差异,且在XY性腺中的表达量显著高于XX。同时对孵化后5、30、90、180天XX和XY性腺转录组数据进行分析不仅证实了以上结果,还发现IGFBP1a、IGFBPlb以及IGFBP6b也在孵化后30天的性腺中有表达。原位杂交结果显示：IGF3和IGFBP3b、IGFBP5a在精巢Leydig细胞中共表达；同时发现,IGFBP3a在卵巢和精巢的体细胞表达,IGFBP4在卵母细胞和间质细胞以及精巢的间质细胞中有表达。另外发现IGFBP5b在Leydig细胞中有表达,而IGFBP2a在精巢的精子细胞表达。综上所述,卵巢过表达IGF3会影响性腺的生长和发育,这些结果表明IGF3可能对卵巢的生长和发育具有重要作用。本研究得到了11个尼罗罗非鱼IGFBP,其中IGFBP2a、IGFBP3a、IGFBP3b、IGFBP4、IGFBP5a、IGFBP5b在性腺中有表达,推测这几个基因可能在性腺的生长以及发育过程中具有重要作用。综合转录组数据分析,配体和结合蛋白性腺个体发生以及原位杂交结果暗示了IGFBP3b或者IGFBP5a可能是IGF3的结合蛋白。