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家蚕杆状病毒基因表达系统是高效的真核表达系统之一。借鉴国外AcMNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,我们曾构建了可利用我国特色经济资源昆虫一家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统。利用细菌转座子的基因定位转移作用,在大肠杆菌内实现基因的重组,快速获得重组病毒。利用该系统,仅需要5-7天就能得到重组病毒。该系统由供体质粒、DH10BmBac细菌感受态细胞和家蚕培养细胞、家蚕幼虫组成,利用该系统能够在家蚕体内表达重组外源蛋白。
在家蚕Bac-to-Bac快速表达系统中,供体质粒为重组病毒的构建提供含有目的基因表达框(启动子+多克隆位点)的转座元件,因此其中的表达框决定了所携外源蛋白的表达方式以及下游蛋白质纯化等的技术路线。然而目前常用的供体质粒如pFastBacHT只能满足一般的重组蛋白表达,没有信号肽序列,难于有效引导表达的外源蛋白分泌到胞外;另外,表达的蛋白由于N端含有较多的附加序列,从而有可能影响重组蛋白的表达效率和理化性质,并有可能进一步影响其生物学活性。
针对上述问题,为了满足家蚕杆状病毒表达系统表达蛋白的不同需要,我们将商品化质粒pFastBacHT进行了如下改造:①将蛋白质分泌信号肽序列插入到pFastBacHT供体质粒中,使表达的重组蛋白能够有效分泌到细胞外。通过基因操作技术,将该杆状病毒信号肽序列gp67 signal sequence重组入pFastBacHT供体质粒中,得到了携带信号肽序列的供体质粒,我们将之命名为pBacGP67a,b,c。采用该供体质粒,表达的蛋白质就能够有效分泌到细胞外,从而有利于外源蛋白的分离纯化;②切除供体质粒pFastBacHT多克隆位点前冗长的附加序列,减少对外源重组蛋白的影响。将pFastBacHT供体质粒多克隆位点前的TEV序列删除,使重组蛋白的N端仅融合为方便重组蛋白纯化而设计的6×His序列。改造后的质粒命名为pFastShorta,b,c。
利用上述构建的供体质粒并利用家蚕Bac-to-Bac表达系统,构建了表达新型抗癌基因工程抗体基因(T2融合蛋白)的重组病毒。分别在家蚕细胞和家蚕幼虫内进行了表达,分析了重组蛋白的表达规律,并利用亲和层析技术纯化了该重组蛋白。生物活性检测结果表明,家蚕幼虫中表达的T2蛋白具有较好的生物学活性,说明利用家蚕能够成功表达抗肿瘤蛋白。
本研究的意义在于:①通过对商品化供体质粒pFastBacHT的改造,开发了两种不同用途的供体质粒,便于重组蛋白的分泌、表达和纯化,以满足不同目的的需要。②利用家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了新型抗癌基因工程抗体T2融合蛋白,摸索并掌握了该蛋白的表达规律、纯化方法,为将来该蛋白的大量生产和医学应用打好基础。