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正常听力对于我们交流和认知非常重要。听力的缺陷深深的影响到社会生活的方方面面。耳蜗螺旋神经元是听觉通路的初级传入神经元，它将声音信息转变为神经冲动并向听觉中枢传导。在哺乳动物，螺旋神经元一旦损伤即不可再生或修复。目前，耳蜗移植干细胞替代受损或缺失的毛细胞和或螺旋神经元治疗由此引起的感音神经性耳聋已成为耳科学研究方面的重点和热点问题。为了顺利把细胞移植入耳蜗，研究者采用了各种不同的手术方法和路径，尽可能把移植细胞送到距离损伤部位较近的位置或者直接送到损伤部位。例如：通过圆窗、鼓阶、半规管把细胞送到外淋巴液系统；也有学者把细胞经中阶直接注入内淋巴液系统或通过基底膜上钻孔把细胞输送到中阶；还有人试图通过听神经中枢端移植入干细胞。外源性干细胞移植后的状态，不仅受移植细胞类型、分化状态、种属来源的影响，还受宿主组织器官状态影响，研究表明，受损器官或组织更利于移植细胞的存活。因此，选择合适的移植细胞类型和受体动物模型，对研究耳蜗移植干细胞存活、增殖、分化和功能重建具有重要意义。同时，研究病理状态下损伤微环境中有关细胞趋化、增殖、分化的分子表达变化，对于我们更好的了解细胞替代治疗的机制和机理也很有帮助。本实验中，我们选择具有嗜神经元毒性的毒毛旋花子甙诱导耳蜗螺旋神经元损伤模型，试图建立单纯的螺旋神经元凋亡，为后续试验打下基础；鉴于耳蜗来源于外胚层，我们通过同样是感觉上皮细胞的嗅球组织来源干细胞作为种子细胞，为了提高其干细胞特性，我们使用胚胎14.5天小鼠嗅球提取、分离干细胞；为了更好的观察移植细胞，我们选择C57BL/6-GFP转基因小鼠作为细胞种属来源；实验中，我们探索了各种手术径路，我们惊奇的发现，移植到耳蜗外侧壁的细胞具有向螺旋神经节迁移的趋势，于是我们设计了耳蜗外侧壁移植细胞的实验，通过观察干细胞在耳蜗的分布来验证该径路是否可行，同时我们在移植位点注射示踪剂，来验证其可靠程度，我们设了假手术对照组，来验证该手术方法对耳蜗功能的影响。最后，我们观察了损伤微环境，CXCL12蛋白表达变化，探讨CXCL12/CXCR4信号通路是否参与耳蜗移植干细胞的迁移和在耳蜗分布的调节。实验一：SD大鼠耳蜗SGNs损伤模型目的：获得单纯螺旋神经元损伤动物模型，为后续实验奠定基础。方法：选用16只成年大鼠，8只圆窗龛给药，8只给生理盐水作为对照，手术打开听泡，暴露圆窗龛，10μl10mM毒毛旋花子甙生理盐水溶液圆窗龛给药，观察给药后ABR阈值变化，耳蜗切片观察螺旋神经元密度改变，毛细胞铺片观察毛细胞情况结果：HE染色显示与正常耳蜗组织切片相比，给药3天，螺旋神经元显著减少，给药7天后，神经元及其他细胞进一步减少，神经节区域呈现一片“荒漠样”改变；tubulin染色阳性细胞（神经元细胞）在给药3天后，细胞数量大幅减少，神经纤维无明显改变；7天后阳性细胞数进一步减少，基底膜铺片结果显示手术后7天，手术组及手术给药组均未见明显内外毛细胞及纤毛的缺失，ABR阈值检测显示手术给药物组ABR阈值显著升高，单纯手术组阈值升高不明显。结论：本实验成功建立了稳定、可靠的单纯螺旋神经元损伤模型，该模型对内耳其他组织和细胞无明显伤害，为研究螺旋神经元损伤和修复机制奠定了基础。实验二：嗅球神经干细胞培养目的：获得GFP+嗅球神经干细胞，并对其干细胞特性及向神经元分化能力进行了鉴定，为耳蜗细胞移植奠定了基础。方法：C57BL/6-GFP转基因小鼠2只，孕14.5天，取胎鼠8—-10只手术获得绣球组织，分离后干细胞培养基悬浮培养，4-5天传代一次，免疫荧光方法鉴定其是否为神经干细胞，体外向神经元方向分化能力。结果：取自胚胎第14.5天C57BL/6-GFP嗅球组织的干细胞在干细胞培养基中生长良好。在荧光显微镜下呈现明亮的绿色荧光。细胞呈悬浮生长，并形成大小不等的神经球，随着培养时间增长，细胞球体积逐渐增大、折光性好，形态饱满，说明细胞活性良好。细胞增殖能力强，每4-5天即需传代，以保持适当细胞密度。细胞虽经多次传代，仍然保持了良好的干细胞特性，贴壁分化细胞较少。免疫细胞化学结果显示，培养的细胞表达GFP,并且大部分细胞表达神经干细胞特异性标志物nestin。表明培养细胞大部分为神经干细胞。培养嗅球干细胞经诱导分化后，大部分表达早期神经元标记物NSE,表明培养细胞具有很强的向神经元分化的能力；同时，部分诱导分化的细胞表达成熟神经元标记物NF200,提示培养细胞分化后转变为成熟的神经元细胞。结论：本实验为耳蜗移植干细胞提供了可示踪的，易向神经元方向分化的，体外扩增容易的理想的种子细胞。实验三：外侧壁径路耳蜗移植干细胞向螺旋神经节迁移途径目的：探讨耳蜗外侧壁干细胞移植后向螺旋神经节迁移能力，同时探讨该手术对耳蜗形态和听觉功能影响。方法：选取成年SD雄性大鼠18只，实验分为三组，一组8只，运用毒毛旋花子甙诱导SGNs损伤，2天后，耳蜗外侧壁移植干细胞；一组正常大鼠两只，分别经耳蜗外侧壁和鼓阶注入荧光金颗粒，观察细胞移植位点；一组正常大鼠8只，分为耳蜗外侧壁手术和鼓阶手术两组，每组各4只8耳，分别观察耳蜗外侧壁和鼓阶模拟移植手术对正常耳蜗形态和听觉功能的影响。结果：移植1周后发现所有移植干细胞组耳蜗均有干细胞存活。移植的细胞主要分布在螺旋韧带、基底膜、骨螺旋板和螺旋神经节区域，其他在鼓阶、前庭阶和中阶也有少量分布。在一个耳蜗中，我们发现GFP+细胞只有少数停留在螺旋韧带，大部分细胞已经迁移到螺旋神经节区域，还有部分细胞位于螺旋韧带和螺旋神经节之间的基底膜及骨螺旋板。细胞分布提示我们基底膜具有潜在间隙允许移植干细胞从螺旋韧带向螺旋神经节迁移。检测到达神经节区域移植细胞的分化情况，我们发现大部分移植细胞不表达Nestin，表明移植干细胞到达螺旋神经节区域后，大部分已经分化，失去干细胞特性；同时发现大部分GFP+细胞表达同时表达Tubulin，提示移植细胞到达螺旋神经节区域后，大部分已经分化为神经元样细胞。荧光金颗粒的分布差异表明我们采用的移植部位是准确的。我们在正常耳蜗模拟了手术操作；同时用鼓阶作为对照。我们发现两种手术对耳蜗螺旋神经元细胞没有明显影响，耳蜗基底膜铺片发现毛细胞基本没有缺失，对手术前后耳蜗ABR阈值检测发现，耳蜗外侧壁移植干细胞的方法对耳蜗功能影响有限。结论：我们的实验发现，耳蜗外侧壁移植干细胞是一个新的耳蜗移植细胞方法，该方法对正常耳蜗功能影响有限，移植的细胞可以迁移到螺旋神经节区域。实验四：耳蜗移植干细胞迁移受CXCL12/CXCR4信号通道调控目的：探讨损伤微环境后CXCL12表达变化，移植干细胞在耳蜗迁移及分布与CXCL12之间关系。方法：取体外培养小鼠嗅球来源干细胞（待移植细胞）检测其CXCL12/CXCR4表达情况，取正常耳蜗、螺旋神经元损伤耳蜗、螺旋神经元损伤后2天后移植干细胞耳蜗组织切片，检测CXCL12表达变化与干细胞迁移及分布关系。结果：免疫荧光染色结果表明，体外培养的神经干细胞表达CXCR4；同时具有分泌CXCL12能力；CXCL12在正常耳蜗即有表达，而在毒毛旋花子甙诱导螺旋神经元损伤3天时，在变性、缺失神经元细胞周围、蜗轴听神经中枢端和骨螺旋板听神经外周端， CXCL12表达明显上调，损伤7天时，螺旋神经节区域表达CXCL12明显下降，这一现象同时出现在听神经的中枢端和外周端。免疫荧光检测发现，移植到前庭阶的神经干细胞在耳蜗内有部分细胞继续表达CXCR4，在聚集的移植细胞团中，CXCL12呈明显的高表达；移植干细胞耳蜗发现，CXCL12在损伤部位表达浓度梯度分布，与干细胞在螺旋韧带、基底膜、骨螺旋板和螺旋神经节分布相吻合。结论：本实验结果表明CXCL12/CXCR4在体外培养嗅球神经干细胞的表达；螺旋神经元损伤后局部CXCL12表达上调；移植细胞在耳蜗表达CXCR4，其聚集部位CXCL12高表达，CXCL12在损伤部位表达浓度梯度分布，与干细胞在螺旋韧带、基底膜、骨螺旋板和螺旋神经节分布相吻合，结果证明移植干细胞在耳蜗的迁移受CXCL12/CXCR4信号通道调控。