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D-阿洛酮糖甜度是蔗糖的70%,但是几乎不含有热量,可应用于食品、医药、保健品等领域。酶法制备D-阿洛酮糖具有专一高效、反应条件温和等优势,逐渐用于大规模的工业化生产。D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase,简称DPEase）可专一催化D-果糖C3位置差向异构化生成D-阿洛酮糖。解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum H10）来源的DPEase具有较好的热稳定性和催化效率。本研究首先将该DPEase在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中重组表达,并进行了酶学性质的研究。接着通过摇瓶和3-L罐发酵优化实现了DPEase的高效表达。最后进一步研究了重组酶制备D-阿洛酮糖以及重组菌的固定化,为工业化生产奠定了基础。主要研究结果如下:（1）构建了重组菌B.subtilis/pHY300PLK-PamyQ-dpe和B.subtilis/pHY300PLK-PhpaΙΙ-PamyQ-dpe,重组菌在摇瓶中培养48 h后,胞内酶活分别达到149.2 U·mL-1和147.5U·mL-1,蛋白电泳显示在33 kDa处出现目的条带,表明来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPEase在B.subtilis中成功表达。进一步考察了重组DPEase的酶学性质。结果表明,重组酶的最适p H为7.5,最适温度为65℃;在pH 7.5和0.1 m M Co2+条件下,其55℃和60℃的半衰期分别为3 h和0.5 h;重组全细胞在4℃的储藏效果较好,15天后残余酶活为82%。（2）为了提高重组酶的表达量,首先在摇瓶中考察了培养基组分对重组菌产DPEase的影响,结果表明:最适培养基组成为大豆蛋白胨20 g·L-1、玉米浆15 g·L-1、甘油5 g·L-1、1 mM Ca2+、K2HPO4 12.54 g·L-1、KH2PO4 2.31 g·L-1,此时DPEase的酶活力达到314.3U·mL-1;进一步在3-L罐中考察了不同补料C/N、发酵pH和温度对DPEase表达量的影响,结果表明发酵最适补料C/N为1:2、pH为7.0、温度33℃,酶活力最终达2246.3 U·mL-1,是摇瓶优化前的15倍;最后我们对重组DPEase的启动子PamyQ进行定点突变,有效的缓解了由于碳源浓度过高引起的蛋白转录阻遏效应,重组菌突变体B.subtilis/pHY300PLK-PamyQ/G212A-dpe在3-L罐中利用高浓度碳源时DPEase酶活力从495.4 U·m L-1提高到1030.6 U·mL-1,由于利用高浓度碳源进行发酵时周期短,且生产成本低,具有一定的工业应用价值。（3）考察了不同反应条件对重组DPEase制备D-阿洛酮糖的影响。确定了最适的酶转化条件如下:反应pH为7.5,反应温度为60℃,加酶量为30 U·g-1底物,反应4 h,300 g·L-1果糖为底物时转化率最高达28.17%;本研究进一步对重组菌全细胞催化生产D-阿洛酮糖的转化工艺进行了优化,当以300 g·L-1果糖作为底物,在反应体系中添加终浓度为10 g·L-1的全细胞,在pH 7.5,65℃下反应1 h,转化率可达27.48%。（4）采用海藻酸钠-硅藻土（吸附-包埋法）对重组菌全细胞进行固定化研究,得到最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度为2%（m/v）,细胞包埋量为50 g·L-1（m/v）,Ca Cl2浓度为2%（m/v）,硅藻土浓度为10 g·L-1（m/v）,在此条件下固定化细胞酶活回收率最高,可达64%。固定化细胞与游离全细胞相比最适pH不变,均为8.0,而最适温度提高了5℃,为70℃。在利用固定化细胞催化生产D-阿洛酮糖时,55℃下重复操作7个批次后,转化率仍保持在28%左右,同时仍保留81%的残留酶活。