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本实验对山东及周边牛场做了乳房炎的检测,采集并分离了129株金黄色葡萄球菌,并对金黄色葡萄球菌毒力因子设计设计相关引物,通过分子PCR的方法,对耐热核酸酶、凝固酶、耐消毒剂基因、杀白细胞素基因、耐甲氧西林基因、α-溶血素及β-溶血素基因做一个分布调查,对它们的做一个基因分型。以重组α-溶血素对小鼠乳腺上皮细胞进行攻击,对细胞因子IL2、IL6、TNF-α进行检测,探讨重组α-溶血素对小鼠乳腺细胞的损伤及凋亡的影响。希望对本实验室所分离金葡菌做一系统的鉴定和分型,构建金葡菌种质资源库,得到金葡菌分子流行病学资料,为奶牛金葡菌引起的乳腺炎的防治提供新思路。1.牛源性金葡菌各种毒力因子基因型的检测设计耐热核酸酶、凝固酶、耐消毒剂基因、杀白细胞素基因、耐甲氧西林基因、α-溶血素及β-溶血素引物,进行PCR检测。表型分型56株表现为α溶血,检出率为43.4%;43株表现为β溶血,检出率为34.11%;另有29株表现为不溶血,检出率为22.48%;其中hla基因检出率34.88%,hlb基因检出率为42.60%。发现46株Pvl基因阳性株,检出率为35.66%;其中coa生化检测(试管法),可使兔血清凝固的有50株,生化方法检出率为38.76%,coa基因检测阳性株有39株,基因检出率为30.23%,其中生化与基因检测能对应的有14株,对应符合率为10.85%;在对nuc(耐热核酸酶)的检测中,甲苯胺蓝生化检测有106株阳性,生化检出率为82.17%,基因检测有31株阳性,基因的检出率为24.03%,其中生化与基因检测能对应的有28株,对应率为21.71%;在对mec-a基因的检测中,共发现有25株阳性株,基因的检出率为19.38%;在对qac-a基因的检测中,发现有13株阳性菌株,基因的检出率为10.08%。在溶血表型中,α溶血要多于β溶血;hlb基因的检出率比hla基因的检出率要高。金黄色葡萄球菌所检出溶血素基因与血琼脂平板出现的溶血现象并非一一对应关系。发现46株Pvl基因阳性株,检出率为35.66%,较人医上的检测率没有较大的差异,说明大多数金葡菌都是含有杀白细胞素。其中50株可使兔血清凝固,检出率为38.76%,凝固酶基因检测阳性株有39株,基因检出率为30.23%,证明凝固酶基因是普遍存在的,与各种文献报道一致。对金葡菌致病性菌株的重要指标之一nuc(耐热核酸酶)的基因检测中有31株阳性,基因的检出率为24.03%,说明此基因检测可以作为对致病性金葡菌检测的一个方法补充。Mec-a的检出,说明在我们山东周边牛场已经出现了MRSA菌株,存在着抗生素滥用及乱用的现象。其中耐消毒剂基因qac-a的检测中,在总样本中金葡菌中共检测出了13株。这说明在山东省的某些牛场里存在着消毒剂的不规范使用,在剂量和各种消毒剂的优化配置上还存在着问题。以分子生物学PCR的方法对上述毒力因子设计引物,进行扩增,检测结果还是显著的。也应注意到PCR的检测结果和生化的检测结果并不是完全一样的,对于基因检出率高的毒力因子,有可能是该基因沉默了,导致相应蛋白不表达;而对于生化检出率高于基因检出率的情况,则要考虑提高基因检测的准确率,增加检测次数以降低差异。2.重组α溶血素对小鼠乳腺细胞的损伤及凋亡研究本实验用已构建好的基因工程菌表达并纯化金葡菌主要毒力蛋白α-溶血素,用其攻击培养的小鼠乳腺细胞,以期比较得出各型金葡菌及各毒力因子的致病性差异,寻求金葡菌保护性抗原。对纯化的α溶血素进行蛋白含量测定,显示为940μg/ml。本实验用重组α-溶血素对小鼠乳腺细胞攻毒,检测细胞因子IL2、IL6、TNF-α。对照组和实验组之间的TNF-α含量呈现先升高后下降的趋势,3组达到最高,5组有升高的趋势。对照组和实验组之间的IL-2和IL-6含量呈现先降低后升高的趋势,且在3组达到峰值。3组乳腺细胞中TNF-α、IL-2和IL-6较对照组存在统计学意义且变化趋势一致。与对照组对比以后,发现重组α-溶血素对小鼠乳腺细胞可引起一定的细胞损伤。通过本实验的开展,希望可以建立金葡菌系统鉴定和分型的技术平台,获得金葡菌的种质资源库,为各种不同型金葡菌引起的危害提供防治数据。初步探讨研究金葡菌重组α-溶血素对乳腺细胞的损伤及凋亡效应,并探索金葡菌及金葡菌毒素能否引起乳腺细胞的凋亡,本实验可为α-溶血素引起的奶牛乳腺炎损伤机理提供数据支持。