论文部分内容阅读
1.研究背景:
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，其发病率与死亡率有逐年上升趋势。目前，手术是乳腺癌治疗的主要手段，但化学药物治疗也是乳腺癌综合治疗一个不可缺少的重要方法，尤其晚期乳腺癌，可在术前、术中及术后进行全身性或区域性辅助化学治疗。然而，乳腺癌细胞对化疗药物易产生多药耐药(multidrug resistance，MDR)，即由一种药物诱发，但同时又对其他多种结构和作用机制迥异的抗癌药物产生交叉耐药，是影响药物疗效及病人预后的主要原因。
肿瘤多药耐药存在多种机制，其中以ABC转运蛋白超家族(ATP—binding cassette transporter superfamily)成员介导的细胞内药物外排在MDR中起了重要作用，也是目前国内外研究的热点之一。该家族中与药物耐受密切相关的蛋白有：由多药耐药基因MDR1 (multidrug resistance 1)所编码ABCB1，又名P—糖蛋白(P—glycop rotein，P—gp)和ABCC1，又名多药耐药相关蛋白(multidrug resistance p rotein，MRP1)，以及新近发现的由ABCG2基因编码的乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)又名(ABCG2/MXP/ABCP)。
虽然ABCG2基因具有一定的生理功能，但其过表达常可介导对米托蒽醌，拓扑替康，氨甲喋呤等的抗癌药物的耐受。研究表明，多药耐药基因ABCG2在乳腺癌中有表达，化疗常引起其过表达，导致多药耐药，影响了乳腺癌的治疗疗效及病人预后。目前，对该基因表达的分子机制尚不清楚。基因结构分析发现，该基因启动子区存在多种转录因子结合位点，并含有丰富的甲基化岛及正性和负性调控区域。MDR1基因启动子区同样存在丰富的甲基化岛，且其表达与DNA甲基化密切相关，同时，有研究表明ABCG2表达与DNA甲基化有关，但在乳腺癌中的研究目前尚无。
因此，本研究拟用米托蒽醌染毒，以建立不同耐药程度的MCF—7/Mit耐药细胞株，收集术前化疗与未化疗的乳腺癌组织标本，进行体内外实验研究，初步探讨乳腺癌多药耐药ABCG2基因表达与DNA甲基化的关系，为逆转由ABCG2蛋白引起的肿瘤多药耐药提供新的靶点，以提高肿瘤病人的化疗疗效，最终改善肿瘤病人的生存质量。
2.方法:
2.1以终浓度为0.005，0.01，0.02，0.04，0.08μM的米托蒽醌，由低浓度开始，对人乳腺癌细胞MCF—7持续染毒，并连续换次高浓度染毒。每个浓度持续染毒30天，诱导细胞耐药。观察细胞形态变化，并绘制细胞生长曲线。
2.2以未染毒的MCF—7为对照，用流式细胞术检测该不同染毒浓度MCF—7细胞对米托蒽醌的耐药性，并用CCK—8法检测其对米托蒽醌，阿霉素及肽素的耐受性。
2.3以免疫荧光，Q—PCR及WesternBlot方法检测不同耐药程度的MCF—7/Mit中ABCG2的表达。同时，用Q—PCR方法检测4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—7细胞中ABCG2mRNA表达，作为阳性对照。
2.4以高效毛细胞管电泳法检测MCF—7/Mit耐药细胞中全基因组甲基化水平，并通过甲基化特异性PCR(MSP)法检测了ABCG2基因启动子区甲基化状况。用4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—7细胞作为阳性对照。
2.5以Q—PCR及WesternBlot方法检测了MCF—7/Mit中DNMT1，DNMT3A及DNMT3B的表达水平。同时，以Q—PCR方法检测用4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—7细胞作为阳性对照。
2.6以Q—PCR检测了术前化疗与未化疗的乳腺癌组织中ABCG2及DNMT1，DNMT3A和DNMT3BmRNA表达水平；MSP法检测ABCG2启动子区甲基化状况。
3.结果:
3.1初次染毒及初次换次高浓度的米托蒽醌染毒时，细胞死亡较多，细胞生长缓慢。从低剂量到高剂量染毒，形态出现一定的变化，且细胞生长相对缓慢。
3.2随着米托蒽醌染毒剂量的增加，MCF—7细胞的耐药性增大；对米托蒽醌的耐药性最大，对阿霉素和肽素的耐药性相似。以0.02μM阶段组MCF—7细胞变化开始明显。
3.3ABCG2蛋白主要表达于细胞膜上，且随MCF—7/Mit耐药性的增加，表达增加，并在0.02阶段组ABCG2表达变化开始显著。
3.4与未染毒的MCF—7细胞相比，MCF—7/Mit细胞中全基因组呈低甲基化趋势，选定的ABCG2启动子区个别位点呈高甲基化趋势。
3.5MCF—7/Mit耐药细胞株中，DNMT1，DNMT3A及DNMT3B表达呈降低趋势，以DNMT3B变化最明显，DNMT1次之。
3.6以术前未化疗的乳腺癌组织为对照，术前化疗的乳腺癌组织中，ABCG2mRNA呈高表达趋势；所选定的ABCG2启动子区个别位点呈高甲基化趋势；DNMT1，DNMT3A及DNMT3B呈低表达趋势，以DNMT3B表达变化明显。
4.结论:
(1)本实验室已成功构建了不同耐药程度的MCF—7/Mit耐药细胞株，为ABCG2蛋白介导耐药表遗传学机制研究提供很好的耐药细胞模型；
(2)乳腺癌中，DNMTs的低表达及ABCG2基因启动子区个别位点的高甲基化状态可能是ABCG2基因差异表达所介导的耐药表型的表遗传学机制之一。
(3)ABCG2基因表达的表遗传学机制研究，为逆转ABCG2介导的多药耐药提供了新的靶点。