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犬猝死症可导致幼龄或青壮龄犬快速死亡,患病动物在发病后数小时内死亡,通常可引起气性坏疽、肠毒血症、出血性肠炎等病症,发病后通常由于无法及时治疗而导致死亡,因此,针对犬猝死症应以预防为主,但目前临床上还没有预防犬猝死症的疫苗。引起犬猝死症的病原主要是产气荚膜梭菌和肉毒杆菌,其中产气荚膜梭菌又是最主要的病原菌。产气荚膜梭菌为一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌,兼性厌氧,可形成芽孢。产气荚膜梭菌根据其所产生的四种主要外毒素(α、β、ε、ι)的基因型不同,可分为A型、B型、C型、D型、E型,其中以A型最为常见,其主要毒力因子是α毒素。肉毒杆菌为革兰氏阳性厌氧菌,主要毒力因子是分泌的肉毒毒素。肉毒毒素可分为A、B、C、D、E、F、G等七个型,其中引起人致病的通常为A型肉毒毒素,引起动物致病常见的为C型肉毒毒素。为了研究犬猝死症疫苗,本研究首先分别建立了产气荚膜梭菌和肉毒毒素动物感染模型(小鼠和犬);然后利用甲醛对培养后的菌液或毒素进行脱毒,优化疫苗有效剂量和佐剂,利用动物模型分别评价产气荚膜梭菌灭活疫苗和肉毒毒素灭活疫苗的安全性和免疫学特性;再优化两种疫苗的比例,制备出预防犬猝死症的二联灭活疫苗。一、A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的研究以不同剂量的产气荚膜梭菌培养物分别对昆明鼠和比格犬通过腹腔注射进行攻毒,建立了产气荚膜梭菌感染小鼠模型和犬模型。产气荚膜梭菌对小鼠和犬的最小致死剂量(MLD)分别是200μL/只(活菌数约为6×10~7 CFU)和2,000μL/只(活菌数约为6×10~8 CFU),感染后1天内动物全部死亡,主要临床症状表现为动物腹部鼓胀,四肢无力,行动迟缓,肛门处有出血,组织病理切片显示小肠出现大量炎性细胞浸润,肺泡壁增厚且肺间质有炎性细胞浸润,肝脏中央静脉周围有轻微纤维化。利用甲醛对产气荚膜梭菌培养物进行灭活,优化了甲醛对产气荚膜梭菌的灭活条件为0.5%甲醛终浓度脱毒48 h。将脱毒后的产气荚膜梭菌培养液分别与油佐剂和铝胶佐剂混合后,分别以腹腔注射和皮下注射的途径免疫小鼠,用ELISA方法检测小鼠血清抗体。结果免疫小鼠血清抗体效价最高可达10~5,皮下注射免疫小鼠的血清抗体水平明显高于腹腔注射免疫小鼠,添加铝佐剂的疫苗免疫产生的血清抗体水平略高于油佐剂疫苗免疫产生的抗体水平。利用小鼠评价产气荚膜梭菌灭活疫苗的免疫保护作用,以200μL/只的剂量对小鼠进行注射免疫2次,免疫间隔14天。加强免疫后第14天进行攻毒,结果铝佐剂皮下注射免疫组小鼠全部存活(10/10),其他免疫组小鼠均有不同程度的死亡,而对照组小鼠全部死亡,表明疫苗具有良好的免疫保护效果。利用小鼠开展的长期免疫水平监测,结果表明小鼠血清抗体于免疫后第28天最高,然后缓慢下降,直到免疫后第120天,抗体水平仍处于较高水平。利用本动物犬评价产气荚膜梭菌灭活疫苗的免疫保护作用,分别以0.5 mL/只、1 mL/只、2 mL/只、4 mL/只的剂量对犬进行免疫,结果采用两次免疫方法(免疫间隔14天),2 mL/只剂量即可对犬完全保护(5/5);采用一次免疫攻毒法,4 mL/只免疫剂量才可对小鼠完全保护(5/5)。本研究还制备了α毒素灭活疫苗。将产气荚膜梭菌在产毒培养基中过夜培养后,离心收集上清,加甲醛使终浓度达到0.5%脱毒48 h后,加入饱和硫酸铵至饱和度为50%,4℃过夜后离心收集沉淀,用原始体积1/10量的PBS溶解,即得到粗提α毒素,将毒素蛋白添加铝胶佐剂后制备毒素灭活疫苗。对犬进行免疫保护性实验,通过皮下免疫犬后在第14天腹腔注射进行攻毒,结果0.5 mL/只剂量单次免疫即可产生完全免疫保护效果(5/5)。二、肉毒毒素灭活疫苗的研究根据报道的C型肉毒毒素基因序列(GenBank登陆号:D90210),根据大肠杆菌的密码子嗜性进行优化,合成了优化后的C型肉毒毒素基因BoNT-C,将合成的BoNT-C基因定向克隆至温控表达性质粒pBV220的EcoRI和BamHI位点之间,构建出携带C型肉毒毒素基因的温控表达重组质粒pBV220-BoNT-C,将该重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,构建出可表达C型肉毒毒素的重组菌株DH5α(pBV220-BoNT-C)。以不同剂量的产C型肉毒毒素重组菌株DH5α(pBV220-BoNT-C)培养物分别对昆明鼠和比格犬进行腹腔注射,结果对小鼠和犬的最小致死剂量(MLD)分别是20μL菌液(活菌数约为1.2×10~7 CFU)和1,000μL菌液(活菌数约为6×10~8CFU),感染后1天内动物全部死亡,主要临床症状表现为动物呼吸急促,行动迟缓,抬头困难等。利用甲醛对重组菌株DH5α(pBV220-BoNT-C)培养物进行灭活,优化灭活条件为0.5%甲醛浓度脱毒24 h。将脱毒后的产肉毒毒素大肠杆菌培养液与铝胶佐剂和油佐剂按比例混合后,分别以皮下注射和腹腔注射的途径免疫小鼠。用ELISA方法检测小鼠血清抗体,结果免疫小鼠血清抗体效价最高可达10~4,铝佐剂组产生抗体水平高于油佐剂组。利用小鼠评价产C型肉毒毒素大肠杆菌灭活疫苗的免疫保护作用,以200μL/只的剂量对小鼠进行注射免疫2次,免疫间隔14天,加强免疫后第14天进行攻毒,结果铝佐剂皮下注射组和铝佐剂腹腔注射组小鼠全部存活(10/10),其他免疫组小鼠均有不同程度的死亡,而对照组小鼠全部死亡,表明灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。利用小鼠开展的长期免疫水平监测,结果表明小鼠血清抗体在免疫后第35天达到最高水平,而后略微下降,从第70天开始至第120天抗体水平虽略微下降但维持在较高水平。利用本动物犬评价产C型肉毒毒素大肠杆菌DH5α灭活疫苗的免疫保护作用,分别以0.5 mL/只、1 mL/只、2 mL/只、4 mL/只的剂量对犬进行免疫,结果采用两次免疫方法(免疫间隔14天),2 mL/只剂量即可对犬完全保护(5/5);采用一次免疫攻毒法,4 mL/只免疫剂量可对犬完全保护(5/5)。本研究制备了肉毒毒素灭活疫苗。将产C型肉毒毒素大肠杆菌DH5α在LB培养基中过夜培养后,离心收集上清,加甲醛使终浓度达到0.5%脱毒24 h后,加入饱和硫酸铵至饱和度为50%,4℃过夜后离心收集沉淀,用原始体积1/10量的PBS溶解,即得到肉毒毒素,将毒素蛋白添加铝胶佐剂后制备毒素灭活疫苗。对犬进行免疫保护性实验,通过皮下免疫犬后在第14天腹腔注射进行攻毒,结果1 mL/只剂量单次免疫即可产生完全免疫保护效果(5/5)。三、犬猝死症二联(α毒素和肉毒毒素)灭活疫苗的研究将α毒素灭活疫苗和肉毒毒素灭活疫苗按1:1、1:2、1:4的毒素蛋白比例混合制备二联灭活疫苗。利用小鼠和犬评价二联灭活疫苗的免疫效果,以200μL/只剂量通过皮下注射对小鼠进行两次免疫,免疫间隔14天,以2 mL/只剂量通过皮下注射对犬进行2次免疫,免疫间隔14天,加强免疫后第14天分别注射产气荚膜梭菌培养物和产C型肉毒毒素重组大肠杆菌培养物进行攻毒,结果混合比例为1:2组对两种毒素同时产生完全免疫保护效果,小鼠(5/5)和实验犬(5/5)全部存活。对未免疫对照组攻毒后死亡犬采集组织进行切片镜检,并对免疫组攻毒后的犬和正常犬安乐死后采集组织进行切片镜检,结果免疫组与正常犬组织均无明显病理变化,未免疫对照组犬经产气荚膜梭菌攻毒后小肠的病理切片出现大量的炎性细胞浸润,肺泡壁明显增厚且肺间质出现大量炎性细胞浸润,肝脏中央静脉纤维化。总结本研究的结果:(1)建立了A型产气荚膜梭菌及产C型肉毒毒素大肠杆菌动物感染模型(小鼠、犬);(2)分别制备了犬A型产气荚膜梭菌及C型肉毒毒素灭活疫苗,优化了疫苗制备方法和免疫方式,动物实验证实疫苗具有良好的安全性和免疫保护作用;(3)制备了犬猝死症二联(α毒素和肉毒毒素)灭活疫苗,优化了疫苗组分配比,动物实验证实该疫苗具有良好的安全性和免疫保护作用,可用于预防A型产气荚膜梭菌和肉毒毒素引起的犬猝死症。