余甘子高效再生体系的建立及遗传转化条件的研究

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余甘子是一种原产于亚洲南部地区,营养丰富的野生果树,具有极高的经济价值和药用价值,我国具有丰富的余甘子野生资源。余甘子的品种改良对余甘子大面积推广种植至关重要。由于余甘子遗传背景较复杂,许多园艺性状的遗传规律尚不清楚,使常规育种受到了很大的限制。植物基因工程技术在果树上的应用,为余甘子品种改良提供了新的途径。本文以余甘子下胚轴为外植体试材,研究了余甘子下胚轴器官形成和植株再生,建立了余甘子高效再生体系。在此基础上探讨了根癌农杆菌介导法对余甘子进行基因转化的研究,初步建立了余甘子遗传转化体系。为余甘子分子育种研究提供了技术参数,为通过基因工程有目的的改良余甘子某些性状莫定了基础。主要研究结果如下: 1.以余甘子下胚轴为外植体,通过器官发生途径诱导不定芽形成,建立了高效的再生体系。探讨了不同激素组合、外植体苗龄、外植体切段来源、AgNO3处理、蔗糖浓度以及暗培养处理等对余甘子下胚轴再生的影响。结果表明,4周苗龄期下胚轴外植体在1/2MS(Murashige and Skoog,1962)+0.5μM NAA+5μM BA附加1mg/L AgNO3、40g/L蔗糖的培养基上,进行14d暗处理后转到光下培养效果最好,5周后不定芽再生率达100%,平均每外植体再生不芽数为11.7个。 2.以余甘子下胚轴为外植体,探讨了各种抗生素对愈伤组织和不定芽形成的影响。结果表明,Kan明显抑制余甘子下胚轴的分化,当Kan浓度达到20mg/L时下胚轴的分化被完全抑制。在诱导不定芽形成中,Cef和Carb对下胚轴愈伤组织形成影响不大,但两者所有浓度处理对不定芽分化都有不同程度的抑制作用。相对而言,选用300mg/L Cef抑菌,对下胚轴不定芽的再生抑制作用较轻,也能够控制农杆菌的生长。综合考虑,余甘子农杆菌介导的遗传转化中,诱导下胚轴愈伤组织和不定芽形成宜选用Cef 300mg/L来抑制农杆菌的生长,Kan筛选的临界浓度为20mg/L。
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