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苏云金素(Thuringiensin,简称Thu)是由某些苏云金芽胞杆菌产生的,具有杀虫活性的小分子核苷类似物。本实验室前期研究通过构建苏云金芽胞杆菌CT-43的总DNA的BAC文库,经过HPLC筛选得到苏云金素的合成基因簇,并对此基因簇进行序列分析。BLAST分析显示,基因thuE的序列和丝氨酸激酶具有较高相似性,推测基因thuE与苏云金素合成途径中的磷酸化有关。在此基础上,对菌株CT-43中的基因thuE进行同源双交换敲除,敲除得到的突变株CT-43-A3不产苏云金素。初步证明基因thuE和菌株CT-43中的苏云金素合成相关。本研究在此基础上,对突变株CT-43-A3中基因thuE的功能进行互补,对基因thuE的体外催化功能进行鉴定。本研究对突变株CT-43-A3中敲除的thuE基因进行功能互补,利用载体pHT304将含有启动子的基因thuE转入突变株CT-43-A3中,得到重组菌株。对得到的重组菌株发酵上清液进行HPLC分析,HPLC结果显示,重组菌株可以恢复Thu的产生。证明基因thuE和Thu的合成相关。本研究利用PCR技术扩增得到菌株CT-43中的基因thuE的完整ORF,扩增到的基因thuE定向克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1中。得到的重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3), IPTG诱导表达,诱导后的菌株利用可以纯化含有GST标签的试剂盒对重组蛋白进行纯化,得到基因thuE的表达产物蛋白ThuE。利用CIAP处理Thu,高效液相色谱和质谱联用检测处理后的物质的分子量为620.1593。处理后的物质在一级质谱的基础上进行二级质谱分析,二级质谱解析分子量为620.1593的物质,并结合推测的苏云金素合成途径,证明CIAP处理Thu得到的分子量为620.1593的物质为不含磷酸基团的前体物。其特征与推测的蛋白ThuE的底物前体物C相同。将蛋白ThuE和前提物C在缓冲体系中进行体外催化处理,高效液相色谱和质谱对催化结果进行分析。结果显示体外催化后的体系中含有Thu。证明蛋白ThuE可以在体外催化体系中和前体物C反应生成Thu。别粘酸是Thu的分子组成成分之一。本研究利用蛋白ThuE对别粘酸进行体外催化分析,对蛋白ThuE的底物特异性进行检测。催化反应体系经过高效液相色谱检测显示,催化后物质的保留时间和别粘酸不同,质谱分析得到新的分子量,说明蛋白ThuE可以在体外催化别粘酸形成新的物质。本研究证明,基因thuE和Thu的合成相关。其功能为,在Thu合成过程中行使磷酸激酶的功能,在前体物C上加上磷酸基团从而合成Thu。此功能符合推测得到的苏云金素合成途径中基因thuE的功能。本研究对基因thuE的功能分析验证了基因thuE在Thu合成途径中的功能,为Thu合成途径的进一步验证打下了良好的基础。