论文部分内容阅读
本文从以下几方面进行论述：
第一部分:不同电针频率对MCAO模型大鼠运动功能及Notch1表达的影响
目的：
利用不同频率电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠进行干预，研究在各个时间点对局灶性脑缺血大鼠运动功能影响，比较不同频率电针对Notch1表达的影响，探讨电针治疗脑缺血适宜的频率及其可能的作用机制。
方法:
90只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、10HZ电针组、20HZ电针组、50HZ电针组。除假手术组外，各组均予制备右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，造模后对大鼠行longa评分，造模成功后（longa评分为1-3分），电针治疗组选取MCAO模型大鼠患侧足三里（ST36）、外关（TE5）两穴。治疗参数采用连续波、电流强度1mA，频率分别选取10HZ、20HZ、50HZ（采用G6805-Ⅱ型电针治疗仪），每天一次，连续治疗7天。假手术组和模型组不做治疗，每组大鼠在术后1、3、5、7天后均进行神经功能评分（mNSS），观察各组大鼠的存活率，各组大鼠在治疗7天后取材行RT-PCR、免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测Notch1表达。统计学数据mNSS评分采用双因素方差分析，其他采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni检验。
结果：
1.假手术组大鼠无死亡，模型组存活率明显下降。模型组与假手术组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；10HZ、20HZ、50HZ电针治疗组存活率明显升高，电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；电针治疗组各组间比较无差异（P＞0.05）；
2.假手术组无神经功能缺失，mNSS评分为0分，术后1天，除假手术组外都有神经功能缺损，模型组、10HZ电针组、20HZ电针组、50HZ电针组这4组间mNSS评分无明显差异（P＞0.05）；缺血后第3天，与模型组相比较，20HZ电针治疗组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001）；缺血后第5天，10HZ、50HZ电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.01），20HZ电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.001），；缺血后第7天，与模型组相比较，10HZ、20HZ、50HZ电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.001）；
结论：
10HZ、20HZ、50HZ电针治疗均能提高局灶性脑缺血大鼠的存活率，同时促进运动功能的恢复，减轻脑损伤，10HZ、20HZ、50HZ电针均能促进局灶性脑缺血大鼠患侧脑缺血组织Notch1表达，以20HZ电针治疗组最为明显，其机制可能与调控Notch信号通路有关。
第二部分：基于Notch/miR-223/NLRP3通路探讨电针治疗对MCAO大鼠抗损伤的影响
目的：
观察电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用及对Notch/miR-223/NLRP3的表达变化的影响，研究电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑损伤所导致的炎症反应的影响，探讨电针抗炎相关作用机制。
方法:
75只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、电针+Scramble组、电针+Antagomir-223组。除假手术组外，各组均予制备右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，造模后对大鼠行longa评分，造模成功后（longa评分为1-3分），电针组、电针+Scramble组、电针+Antagomir-223组选取MCAO模型大鼠患侧外关（TE5）和足三里（ST36）两穴。治疗参数采用连续波、电流强度1mA，频率20HZ（采用G6805-Ⅱ型电针治疗仪），每天治疗一次，连续7天。假手术组和模型组不做治疗，每组大鼠在术后1、3、5、7天后均进行神经功能评分（mNSS），各组大鼠在治疗7天后取材分别行TTC染色评价脑梗死体积、HE染色观察组织形态变化、RT-PCR检测Notch1mRAN、miR-223表达、免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测Notch、NLRP3、Caspase-1蛋白水平表达，ELISA检测IL-1β、IL-18蛋白水平表达。统计学数据mNSS评分采用双因素方差分析，其他采用t检验和单因素方差分析。
结果：
1.假手术组无神经功能缺失，mNSS评分为0分，术后1天，除假手术组外都有神经功能缺损，模型组、电针组、电针+Scramble组、电针+Antagomir-223组这4组间mNSS评分无明显差异（P＞0.05）；电针治疗后第3、5、7天，电针组与模型组相比较，电针治疗组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），电针组与电针+Scramble组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针治疗后第3天，电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），电针治疗后第5、7天，电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
2.对大鼠脑组织行TTC染色法显示，电针组与模型组比较，电针组大鼠脑梗死体积明显减小，统计有显著差异（P＜0.01），电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组梗死体积明显较少，统计有显著差异（P＜0.05），电针组与电针+Scramble组梗死体积相比较，无明显差异（P＞0.05）。
3.HE染色结果：假手术组大鼠脑组织形态、结构正常，神经细胞排列整齐，细胞质饱满，细胞核清晰；与之相比较，模型组大鼠脑缺血梗死区神经元及神经胶质细胞明显减少，残存神经元核固缩，间质高度水肿；而经过电针治疗可缓解脑组织损伤程度，病理性改变有所改善。电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组脑组织损伤程度较轻。
第三部分：基于Notch/miR-223/PTEN通路探讨电针治疗对MCAO大鼠内源性NSCs增殖的影响
目的：
利用电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠进行干预，研究电针对局灶性脑缺血大鼠海马及侧脑室室管膜下区NSCs增殖的影响，探索其可能的机制。
方法:
首先将45只雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、电针组（EA）。7天后取材分别行HE染色观察组织形态变化、TUNEL染色检测凋亡细胞、免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测海马区Notch1表达，实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-PCR）、免疫组织蛋白印迹（Westernblot）检测海马区、SVZ区miR-223、PTEN、Nestin表达。并做miR-223、PTEN、Nestin之间的相关性分析，利用双荧光素酶报告基因系统验证miR-223与PTEN之间的关系。然后将45只大鼠随机分成模型组（Model）、电针+Control组（EA+Control）、电针+antagomiR-223-3p组（EA+antagomiR-223-3p），7天后同样取材分别行RT-PCR检测海马区、SVZ区miR-223、PTEN、Nestin表达。免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测海马区、SVZ区PTEN、Nestin表达。统计学数据分析采用t检验和单因素方差分析。
结果：
1.HE染色结果：假手术组大鼠脑组织神经细胞排列整齐，形态、结构正常；假手术组与模型组大鼠相比较，模型组大鼠脑缺血梗死区神经元及神经胶质细胞明显减少，排列疏松，残存神经元核固缩，间质水肿；经过电针治疗后，电针组与模型组相比较，电针组脑组织损伤程度较轻，病理性改变有所改善。
2.Tunel染色结果：假手术组脑组织切片Tunel染色未见明显病理学改变，细胞形态完整，未见TUNEL阳性细胞。模型组梗死组织坏死，可见许多深染、固缩核细胞，凋亡细胞被染成棕褐色，电针治疗后能够减轻脑缺血损伤后的细胞凋亡。可缓解脑组织损伤程度。
2.RT-PCR结果：模型组和假手术组相比，模型组在SVZ区和海马组织中miR-223表达显著下调（P＜0.01），电针治疗后，电针组和模型组相比，电针组miR-223在SVZ区和海马组织中的表达明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.001），模型组和假手术组相比，模型组在SVZ区和海马组织中PTEN mRNA的表达显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.001）。电针治疗后电针组和模型组相比，电针组PTEN mRNA表达显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.001）。在SVZ区和海马组织中Nestin mRNA表达显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.01），电针治疗后，电针组和模型组相比，电针组Nestin mRNA在SVZ区和海马组织中的表达明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
结论：
1.PTEN基因是miR-223直接作用的靶基因，且miR-223结合于PTEN基因的3’-UTR区域，在转录后水平对PTEN基因有直接抑制作用。
2.电针治疗MCAO大鼠可能通过Notch/miR-223/PTEN通路促进大鼠内源性NSCs增殖，从而发挥神经保护作用。
第一部分:不同电针频率对MCAO模型大鼠运动功能及Notch1表达的影响
目的：
利用不同频率电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠进行干预，研究在各个时间点对局灶性脑缺血大鼠运动功能影响，比较不同频率电针对Notch1表达的影响，探讨电针治疗脑缺血适宜的频率及其可能的作用机制。
方法:
90只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、10HZ电针组、20HZ电针组、50HZ电针组。除假手术组外，各组均予制备右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，造模后对大鼠行longa评分，造模成功后（longa评分为1-3分），电针治疗组选取MCAO模型大鼠患侧足三里（ST36）、外关（TE5）两穴。治疗参数采用连续波、电流强度1mA，频率分别选取10HZ、20HZ、50HZ（采用G6805-Ⅱ型电针治疗仪），每天一次，连续治疗7天。假手术组和模型组不做治疗，每组大鼠在术后1、3、5、7天后均进行神经功能评分（mNSS），观察各组大鼠的存活率，各组大鼠在治疗7天后取材行RT-PCR、免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测Notch1表达。统计学数据mNSS评分采用双因素方差分析，其他采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni检验。
结果：
1.假手术组大鼠无死亡，模型组存活率明显下降。模型组与假手术组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；10HZ、20HZ、50HZ电针治疗组存活率明显升高，电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；电针治疗组各组间比较无差异（P＞0.05）；
2.假手术组无神经功能缺失，mNSS评分为0分，术后1天，除假手术组外都有神经功能缺损，模型组、10HZ电针组、20HZ电针组、50HZ电针组这4组间mNSS评分无明显差异（P＞0.05）；缺血后第3天，与模型组相比较，20HZ电针治疗组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001）；缺血后第5天，10HZ、50HZ电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.01），20HZ电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.001），；缺血后第7天，与模型组相比较，10HZ、20HZ、50HZ电针治疗组与模型组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.001）；
结论：
10HZ、20HZ、50HZ电针治疗均能提高局灶性脑缺血大鼠的存活率，同时促进运动功能的恢复，减轻脑损伤，10HZ、20HZ、50HZ电针均能促进局灶性脑缺血大鼠患侧脑缺血组织Notch1表达，以20HZ电针治疗组最为明显，其机制可能与调控Notch信号通路有关。
第二部分：基于Notch/miR-223/NLRP3通路探讨电针治疗对MCAO大鼠抗损伤的影响
目的：
观察电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用及对Notch/miR-223/NLRP3的表达变化的影响，研究电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑损伤所导致的炎症反应的影响，探讨电针抗炎相关作用机制。
方法:
75只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、电针+Scramble组、电针+Antagomir-223组。除假手术组外，各组均予制备右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，造模后对大鼠行longa评分，造模成功后（longa评分为1-3分），电针组、电针+Scramble组、电针+Antagomir-223组选取MCAO模型大鼠患侧外关（TE5）和足三里（ST36）两穴。治疗参数采用连续波、电流强度1mA，频率20HZ（采用G6805-Ⅱ型电针治疗仪），每天治疗一次，连续7天。假手术组和模型组不做治疗，每组大鼠在术后1、3、5、7天后均进行神经功能评分（mNSS），各组大鼠在治疗7天后取材分别行TTC染色评价脑梗死体积、HE染色观察组织形态变化、RT-PCR检测Notch1mRAN、miR-223表达、免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测Notch、NLRP3、Caspase-1蛋白水平表达，ELISA检测IL-1β、IL-18蛋白水平表达。统计学数据mNSS评分采用双因素方差分析，其他采用t检验和单因素方差分析。
结果：
1.假手术组无神经功能缺失，mNSS评分为0分，术后1天，除假手术组外都有神经功能缺损，模型组、电针组、电针+Scramble组、电针+Antagomir-223组这4组间mNSS评分无明显差异（P＞0.05）；电针治疗后第3、5、7天，电针组与模型组相比较，电针治疗组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），电针组与电针+Scramble组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针治疗后第3天，电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），电针治疗后第5、7天，电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组mNSS评分明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
2.对大鼠脑组织行TTC染色法显示，电针组与模型组比较，电针组大鼠脑梗死体积明显减小，统计有显著差异（P＜0.01），电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组梗死体积明显较少，统计有显著差异（P＜0.05），电针组与电针+Scramble组梗死体积相比较，无明显差异（P＞0.05）。
3.HE染色结果：假手术组大鼠脑组织形态、结构正常，神经细胞排列整齐，细胞质饱满，细胞核清晰；与之相比较，模型组大鼠脑缺血梗死区神经元及神经胶质细胞明显减少，残存神经元核固缩，间质高度水肿；而经过电针治疗可缓解脑组织损伤程度，病理性改变有所改善。电针+Scramble组与电针+Antagomir-223组相比较，电针+Scramble组脑组织损伤程度较轻。
第三部分：基于Notch/miR-223/PTEN通路探讨电针治疗对MCAO大鼠内源性NSCs增殖的影响
目的：
利用电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠进行干预，研究电针对局灶性脑缺血大鼠海马及侧脑室室管膜下区NSCs增殖的影响，探索其可能的机制。
方法:
首先将45只雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、电针组（EA）。7天后取材分别行HE染色观察组织形态变化、TUNEL染色检测凋亡细胞、免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测海马区Notch1表达，实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-PCR）、免疫组织蛋白印迹（Westernblot）检测海马区、SVZ区miR-223、PTEN、Nestin表达。并做miR-223、PTEN、Nestin之间的相关性分析，利用双荧光素酶报告基因系统验证miR-223与PTEN之间的关系。然后将45只大鼠随机分成模型组（Model）、电针+Control组（EA+Control）、电针+antagomiR-223-3p组（EA+antagomiR-223-3p），7天后同样取材分别行RT-PCR检测海马区、SVZ区miR-223、PTEN、Nestin表达。免疫组织蛋白印迹（Western blot）检测海马区、SVZ区PTEN、Nestin表达。统计学数据分析采用t检验和单因素方差分析。
结果：
1.HE染色结果：假手术组大鼠脑组织神经细胞排列整齐，形态、结构正常；假手术组与模型组大鼠相比较，模型组大鼠脑缺血梗死区神经元及神经胶质细胞明显减少，排列疏松，残存神经元核固缩，间质水肿；经过电针治疗后，电针组与模型组相比较，电针组脑组织损伤程度较轻，病理性改变有所改善。
2.Tunel染色结果：假手术组脑组织切片Tunel染色未见明显病理学改变，细胞形态完整，未见TUNEL阳性细胞。模型组梗死组织坏死，可见许多深染、固缩核细胞，凋亡细胞被染成棕褐色，电针治疗后能够减轻脑缺血损伤后的细胞凋亡。可缓解脑组织损伤程度。
2.RT-PCR结果：模型组和假手术组相比，模型组在SVZ区和海马组织中miR-223表达显著下调（P＜0.01），电针治疗后，电针组和模型组相比，电针组miR-223在SVZ区和海马组织中的表达明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.001），模型组和假手术组相比，模型组在SVZ区和海马组织中PTEN mRNA的表达显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.001）。电针治疗后电针组和模型组相比，电针组PTEN mRNA表达显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.001）。在SVZ区和海马组织中Nestin mRNA表达显著下调，差异具有统计学意义（P＜0.01），电针治疗后，电针组和模型组相比，电针组Nestin mRNA在SVZ区和海马组织中的表达明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
结论：
1.PTEN基因是miR-223直接作用的靶基因，且miR-223结合于PTEN基因的3’-UTR区域，在转录后水平对PTEN基因有直接抑制作用。
2.电针治疗MCAO大鼠可能通过Notch/miR-223/PTEN通路促进大鼠内源性NSCs增殖，从而发挥神经保护作用。