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12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)是佛波酯类化合物中活性较高的一种,具有诱导多种肿瘤细胞分化的作用。TPA在诱导肺腺癌细胞分化的同时对细胞功能方面的影响尚未见报道,如粘附能力、迁移运动、侵袭能力等。目的主要观察TPA对人肺腺癌A549细胞在迁移运动能力、侵袭能力和对顺铂敏感性等方面的影响。方法1细胞培养所用细胞均在环境条件为37℃±0.3℃、相对湿度≥95%、C02浓度5%±0.1%的细胞培养箱内用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基传代培养。实验所用的细胞为A549细胞、A549/TPA细胞、A549/R-CDDP细胞。A549/TPA细胞：A549细胞用含5ng/ml TPA、10%胎牛血清的RPMI1640传代培养,9个月后筛选出的能够在含5ng/ml TPA的培养基中稳定贴壁生长的细胞。然后用含5ng/ml TPA的培养基传代培养,用于实验。A549/R-CDDP细胞：A549细胞用含不同浓度顺铂、10%胎牛血清的RPMI1640培养10个月后,筛选出能够在含2μg/ml顺铂的培养基中稳定生长的细胞,耐药倍数达10倍以上,可以认为是耐顺铂的A549细胞。然后用含2μg/ml顺铂的培养基传代培养,用于实验。2实验方法应用MTT比色法、人工细胞计数法、平板克隆形成实验观察TPA对细胞增殖特性和细胞形态的影响。用流式细胞仪并结合免疫细胞化学的方法,判断TPA对细胞周期的影响。用MTT比色法测定TPA联合顺铂对A549细胞的敏感性。用细胞计数的方法测定细胞对人工基底膜的粘附能力、运动能力,对Transwell侵袭小室的侵袭能力,用流式细胞仪测定趋化因子受体(CXCR4)表达的变化。结果1 TPA对细胞增殖特性的影响MTT实验结果表明,A549细胞用TPA 1ng/ml、5ng/ml处理组的抑制率与对照组相比无统计学差异,TPA 10ng/ml处理组与对照组相比有统计学差异。TPA对A549细胞时间依赖关系分析,TPA 5ng/ml处理组从第3天开始出现有大量的悬浮细胞,而对照组无此现象；A549/TPA细胞的TPA5ng/ml处理组从第4天开始与对照组存在统计学差异,且失去对数生长的特性,单位面积的细胞密度降低,7天后A549/TPA细胞密度是对照组的27.31%。平板克隆形成实验的结果显示A549细胞用TPA 1ng/ml、5ng/ml处理组存活分数与对照组相比分别降低44.20%、72.10%,A549/TPA细胞的TPA 5ng/ml处理组的存活分数与对照组相比降低52.30%。2 TPA对细胞形态学的影响平板克隆形成实验中,A549细胞的TPA 1ng/ml、5ng/ml处理组和A549/TPA细胞组都存在细胞质出现空泡或类似网球拍状的空泡细胞现象,而对照组无此现象。A549细胞的TPA 1ng/ml、5ng/ml处理组的空泡细胞所占整个克隆集落的比例分别为8.41%、26.38%。3 TPA对细胞周期Go期和G1期的影响结果显示,TPA促进A549细胞的G0期细胞进入G1期并把A549细胞阻滞在G1期,A549/TPA细胞的这种结果更显著。4 TPA增强细胞对顺铂敏感性A549细胞,单用顺铂时IC50为0.46μg/ml,联合TPA时顺铂的IC50为0.16μg/ml; A549/TPA细胞,联合TPA时顺铂的IC50为0.08μg/ml。A549/R-CDDP细胞,单用顺铂时IC50为6.98μg/ml, TPA处理三天后联合TPA时顺铂的IC50为3.02μg/ml。实验各组所使用的TPA浓度为5ng/ml在此浓度下单用TPA的抑制率与各自对照组相比无统计学差异。5 TPA对细胞的粘附、运动、侵袭能力和趋化因子受体(CXCR4)表达的影响5.1对人工基底膜粘附能力的影响TPA处理组与对照组相比粘附能力降低73.91%。5.2对细胞在人工基底膜上运动能力的影响在人工基底膜上培养细胞后,对照组出现相互交织成网状结构的“晶格”形态,细胞链接、缠绕在一起形成的“管道”,而TPA处理组的细胞单个散在分布不能形成“晶格”和“管道”状形态。5.3对侵袭能力的影响TPA处理组与对照组相比侵袭能力降低52.27%。5.4对趋化因子受体(CXCR4)表达的影响TPA处理A549细胞24h后,CXCR4的阳性表达率和荧光强度与对照组相比无统计学差异。TPA处理5d后收集的悬浮细胞组CXCR4的阳性表达率和荧光强度与对照组相比分别降低52.57%、22.84%。TPA处理5d后收集的贴壁细胞组分别降低27.14%、16.46%。结论1 TPA具有抑制A549细胞增殖,增加对顺铂的敏感性的作用。2 TPA具有降低A549细胞的粘附、运动、侵袭的能力,减少CXCR4表达的作用。