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花生过敏是最严重的食物过敏之一,仅微量花生过敏原便可以引发严重的过敏反应,且花生过敏一般是不会随着年龄增长而消失的。热加工作为常见的花生制品加工方式,会造成蛋白质构象的变化,可能会使得花生过敏原表位暴露或生成新的过敏原表位,从而对花生过敏原的潜在致敏性产生一定的影响。为了降低引发过敏反应的风险,在许多研究中,采用了不同热加工方式来降低花生过敏原的致敏性,但对热加工造成花生过敏原蛋白结构改变的具体位点,以及进而影响过敏原表位的机制鲜有报道。本论文以新鲜花生为研究对象,采用不同的热加工方式对其进行处理,再将蛋白分离出来,分析不同热加工对花生主要过敏原的结构以及潜在致敏性的影响。首先,将花生制备成花生脱脂粉,再提取出花生全蛋白,对花生主要过敏原蛋白Ara h 1、Arah2和Ara h 3进行初步分离;其次,利用质谱对它们的酶解肽段信息分别进行分析,结合相应过敏原蛋白的空间结构模型,探讨不同热加工后,三种主要过敏原蛋白空间结构的变化。最后,结合三种主要过敏原蛋白的过敏原表位,分析不同热加工对花生主要过敏原Arah 1、Arah 2和Arah 3潜在致敏性的影响。本研究的主要方法、结果和结论如下:1.首先,对鲜花生进行不同热加工处理:带壳/去壳水煮(均为100℃,15 min)、带壳烘焙(170℃,35 min)、去壳烘焙(170℃,20 min)和去壳油炸(152℃,400 s),再统一去壳去种皮,研磨后,经丙酮脱脂获得花生脱脂粉。采用高离液序列盐溶液对脱脂粉进行全蛋白的提取,通过SDS-PAGE法对花生主要过敏原蛋白Arah 1、Arah 2和Ara h 3进行分离,将不同热加工的Ara h 1单体蛋白的胶块切下,分别进行胶内酶解。经质谱检测,获得Ara h 1的酶解肽段信息,与Arah1的空间结构模型相结合,分析不同热加工前后Ara h 1蛋白空间结构的变化。同时,结合Arah1的过敏原表位,分析不同热加工对Arah1潜在致敏性的影响。结果表明,水煮加工后,Arah1蛋白条带没有明显的变化;烘焙和油炸加工后,Ara h 1单体含量明显降低,且在大于180 kDa处也都出现了高聚物蛋白条带。在鲜花生和不同热加工花生样品中,共检出Arah 1的79条肽段。不同热加工后,花生Ara h 1单体中检出的肽段数量均下降,带壳烘焙花生中最少。其中鲜花生中检出72条肽段,带壳水煮花生中检出57条,去壳水煮花生中检出65条,带壳烘焙花生中检出32条,去壳烘焙花生中检出56条,油炸花生中检出42条。经质谱检测Ara h 1的氨基酸覆盖率分别为:鲜花生达到了 79.2%,带壳水煮69.88%,去壳水煮71.38%,带壳烘焙43.93%,去壳烘焙70.55%,油炸55.41%。说明热加工破坏Arah 1的蛋白质结构,影响了胰蛋白酶酶切位点的暴露。鲜花生中检出的Ara h 1肽段,涉及了 20个Ara h 1过敏原线性表位。带壳水煮和去壳水煮花生中均检出17个过敏原线性表位,去壳烘焙、油炸和带壳烘焙花生中,检出的过敏原线性表位数量依次减少,分别为19、16和13个。经过质谱前处理,被酶解破坏的线性表位数量分别为:鲜花生17个,带壳水煮15个,去壳水煮15个,带壳烘焙10个,去壳烘焙14个,油炸13个。不同热加工均会破坏Arah1的高级结构,带壳烘焙和油炸加工后,Arah 1的结构紧实程度最高;与这两种加工方式相比,水煮造成Arah1结构紧实的程度较轻微。热加工后Arah1结构趋于紧实,使得部分酶切位点被掩盖,从而降低了酶解对Ara h 1过敏原线性表位的破坏程度。2.花生全蛋白经过电泳初步分离后,将不同热加工前后的Ara h 2蛋白胶块切下,分别进行胶内酶解和质谱检测。结果表明,不同热加工后,花生Ara h 2蛋白条带均有不同程度的变浅。烘焙和油炸后,Ara h 2蛋白条带还呈现了弥散状,带壳烘焙花生的弥散程度尤为明显。在鲜花生和不同热加工花生样品中,共检出Arah 2的27条肽段。不同热加工后,花生中检出Arah 2的肽段数量均增加,油炸花生中最多。其中鲜花生中检出15条肽段,带壳水煮花生中检出16条,去壳水煮花生中检出19条,带壳烘焙和去壳烘焙花生中均检出18条,油炸花生中检出20条。Arah 2的氨基酸覆盖率分别为:鲜花生和带壳水煮花生均为61.59%,去壳水煮为75.5%,带壳烘焙为72.85%,去壳烘焙为74.83%;油炸花生中氨基酸覆盖率最高,达到了 80.13%。可见,在除带壳水煮以外的热加工后,检出Ara h 2肽段的数量和氨基酸覆盖率均提高了,说明热加工Arah2高级结构可能遭到了不同程度的破坏,暴露了 Ara h 2更多的酶切位点。鲜花生和带壳水煮花生中检出的Arah2肽段,均涉及了 8个Arah2过敏原线性表位;去壳水煮、烘焙和油炸花生中,检出的Arah2肽段均涉及了 10个线性表位。经过质谱前处理,被酶解破坏的线性表位数量分别为:鲜花生5个,带壳水煮5个,去壳水煮6个,带壳烘焙6个,去壳烘焙7个,油炸花生7个。不同热加工均会破坏Ara h 2的二硫键,造成蛋白结构的舒展,其中带壳烘焙对Ara h 2结构的破坏作用最大,带壳水煮的破坏作用最小。Arah2结构的舒展会暴露更多的胰蛋白酶酶切位点,其中带壳水煮对Ara h 2的线性表位几乎不造成影响,而去壳水煮、烘焙和油炸均会增强对Ara h 2线性表位的破坏程度。3.花生全蛋白经过电泳初步分离后,将不同热加工前后的Ara h 3蛋白胶块切下,分别进行胶内酶解和质谱检测。结果表明,不同热加工后,花生Ara h 3蛋白条带均有不同程度的变浅。带壳烘焙后,Arah3的蛋白条带更细窄,且呈现很明显的弥散状。在鲜花生和不同热加工花生样品中,共检出Arah3的74条肽段,且热加工后花生中检出Ara h 3的肽段数量均增加,带壳水煮中最多。鲜花生中仅检出其中48条肽段,带壳水煮花生中检出64条,去壳水煮、带壳烘焙和油炸花生中均检出55条,去壳烘焙花生中检出51条。Ara h 3的氨基酸覆盖率分别为:鲜花生达到了 65.49%,带壳水煮、去壳水煮和去壳烘焙花生均为70.98%,带壳烘焙花生为73.33%,油炸花生为71.18%。鲜花生与不同热加工花生中,检出的Arah3肽段均涉及2个Arah3过敏原线性表位,且经质谱前处理后,线性表位均会被胰蛋白酶酶解破坏。水煮加工对Ara h 3高级结构的改变程度最低,烘焙和油炸加工对Ara h 3的高级结构改变程度较大,尤其是带壳烘焙。热加工导致的Ara h 3结构变化,影响了酶切位点的暴露情况,但并未改变热加工前后的线性表位被酶解破坏情况。