【摘 要】
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木霉（Trichoderma spp.）是应用最广泛的生物防治剂之一,又因其能耐受或降解多种有毒环境污染物,而在生物修复领域表现出巨大潜力。探究木霉对环境中有毒物质的耐受能力,揭示其耐受的分子机制,是更好地将木霉用于环境修复的前提。因此本研究以棘孢木霉（T.asperellum）为研究对象,选用典型环境污染物重金属镉（Cadmium,Cd）处理为胁迫条件,探究棘孢木霉耐受镉相关基因——zfc1的功
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木霉（Trichoderma spp.）是应用最广泛的生物防治剂之一,又因其能耐受或降解多种有毒环境污染物,而在生物修复领域表现出巨大潜力。探究木霉对环境中有毒物质的耐受能力,揭示其耐受的分子机制,是更好地将木霉用于环境修复的前提。因此本研究以棘孢木霉（T.asperellum）为研究对象,选用典型环境污染物重金属镉（Cadmium,Cd）处理为胁迫条件,探究棘孢木霉耐受镉相关基因——zfc1的功能,为棘孢木霉耐受重金属离子相关机理的研究奠定理论基础,对棘孢木霉更好的应用于生物防治、各种复杂环境条件下的重金属修复和多技术联合修复有重要的指导意义。主要研究结果有:1、克隆出zfc1全长片段,zfc1全长3732 bp,生物信息学分析软件预测zfc1编码蛋白含有C2H2型锌指等DNA结合结构域,且定位于细胞核内,故推测zfc1为C2H2型锌指蛋白基因。实时荧光定量PCR分析该基因在150 mg/L Cd2+胁迫下表达显著升高,表明zfc1可能是棘孢木霉耐受镉相关基因。2、通过根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化法,构建了zfc1基因敲除株（Δzfc1）。本研究成功构建了敲除载体p C1300qh-up-down,采用根瘤农杆菌AGL-1介导棘孢木霉遗传转化,筛选出了30个可能的转化子,分别以每株可能转化子的基因组DNA为模板,进行3对引物（zfc1F/R、hph F/R、up F/down R）的扩增验证,再通过Southern blot验证,确认转化子T17为hph单拷贝整合的Δzfc1。3、通过比较分析棘孢木霉zfc1基因敲除株与野生株（wild-type,WT）的差异,分析zfc1对棘孢木霉生长,耐受镉的影响。实验结果显示,在PDA平板上Δzfc1与WT在菌落形态上无明显差异,但Δzfc1的生长速率快于WT。在含有不同浓度Cd2+的PDA平板上,Δzfc1的菌落生长速率均比WT慢,而在含有不同浓度的其他几种环境污染物（敌敌畏、双酚A、双酚S）的PDA平板上,未出现Δzfc1的生长速率慢于WT的现象。研究结果表明,zfc1负调控棘孢木霉的生长,且在棘孢木霉耐受重金属镉胁迫时发挥重要作用。4、最后通过比较镉胁迫下Δzfc1与WT吸附、富集镉能力,菌丝形态,胞内结构,以及代谢组分的差异,分析zfc1调控棘孢木霉耐镉机理。ICP-MS法测定WT与Δzfc1菌丝体对重金属镉的吸附与富集能力,结果发现zfc1的缺失可导致菌株的镉吸附率下降7.77%,镉富集量下降2倍有余。扫描电子显微镜结果显示Cd2+胁迫下棘孢木霉细胞质收缩,菌丝断裂甚至溶解,且Δzfc1的这种毒性效应更加显著。代谢组学分析结果显示Cd2+胁迫下,zfc1的缺失导致菌株代谢组分发生显著变化,其中有36个显著下调,23个显著上调。这些差异代谢物主要富集在ABC转运等代谢通路上,在ABC转运代谢通路中差异代谢物脯氨酸显著下调。研究结果表明,在Cd2+胁迫下棘孢木霉zfc1表达升高,其基因产物可能通过调节脯氨酸含量等代谢途径来减轻细胞镉毒害,从而增强菌株耐镉能力。
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