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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)现今已经成为仅次于阿尔兹海默症的第二大神经系统退行性疾病。PD的运动症状(运动迟缓、震颤、肌强直和姿势步态异常)为人们所熟知,但其非运动症状常常被忽视;认知障碍是最常见且具有致残性的非运动症状,其中包括PD轻度认知障碍(PD mild cognitive impairment,PD-MCI)和PD痴呆(PD dementia,PDD),MCI是PD晚期发生痴呆的预警信号之一。研究显示,当诊断为PD时,将近30%患者已患有MCI;超过40%认知功能正常的PD患者将在6年内发展为MCI,而到了PD晚期,将近80%的患者可出现PDD。PDD严重损害患者的身心健康,显著降低其生活质量,给家庭和社会带来沉重的负担。因此,若能及时检测和早发现并进行干预,有利于阻止晚年痴呆的发展。但目前并无早期诊断PD认知障碍的生物标志物,其症状性治疗获益有限,也尚无充分证据表明任何一种药物有确切的疾病修饰疗效、从而延迟PD患者的认知下降。葡萄糖脑苷酯酶(Glucocerebrosidase,GBA)功能丧失突变与PD的严重认知障碍相关,GBA突变的PD患者认知下降的速度更快。同时,敲除GBA基因后,细胞内异常聚集状态的α-Syn(α-Synuclein)单体比例上升,从而易导致PD的发病。而且目前的研究表明GBA功能降低增加了α-Syn水平,促进其朊蛋白样传播以及促进α-Syn聚集,加重PD认知障碍。但GBA基因表达量的变化如何引起PD致病基因SNCA变化从而导致PD发病和认知障碍下降的分子机制仍然尚未明确。为了发现潜在的PD-MCI早期诊断的分子遗传标记以及建立GBA与编码α-Syn的SNCA基因之间的关系从而阐明其在PD发病中所扮演的角色,本研究通过生物信息学分析,结合ENCODE,GTEx,1000GENOME,Ch IP-seq数据,e QTL数据,GWAS SNP以及Hi-C等数据库信息,找到一个可能与GBA表达有关的SNP,并在细胞水平,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay),细胞免疫荧光等几种技术对该变异进行功能验证,结果如下:1)结合ENCODE,GTEx,1000GENOME,Ch IP-seq数据,e QTL数据,GWASSNP以及Hi-C等数据库,通过生物信息学分析,鉴定到一个潜在的包含转录因子结合位点的GBA基因调控区域,该调控序列中存在一个SNP rs12411216位于转录因子核心结合motif附近,e QTL数据提示该SNP与GBA基因的表达相关。2)为了阐明该SNP在PD-MCI群体中的分布情况,通过GBA基因分型发现,rs12411216在306名患者中的C/C基因型的频率是65.38%,C/A基因型的频率是26.93%,A/A基因型的频率是7.69%;相关性分析发现,该SNP与PD-MCI显著相关(P=0.048<0.05)。PD-MCI患者中SNP rs12411216的等位基因频率:A为34.84%,C为65.16%,这与千人基因组计划中的的数据接近;3)为了进一步揭示该变异是否与GBA表达有关,q PCR结果及统计学分析发现,在50名PD患者中,rs12411216纯合突变基因型(A/A)的GBA表达量显著低于野生型(C/C)和杂合突变(C/A)(P=0.007<0.05),表明rs12411216与GBAm RNA表达相关。4)为了探究该rs12411216是否为GBA基因的功能性突变,本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别对SH-SY5Y细胞的DHS序列(chr1:155164145-155164895)进行敲除和SNP rs12411216(C-A)进行替换,通过Real-time PCR与Western blot实验证实敲除DHS和替换SNP后,在m RNA水平,相比于野生型,敲低后的细胞中,GBA表达显著减少,但SNCA基因的表达并未有明显差异;在蛋白水平上,GBA蛋白和SNCA编码的α-Syn有明显的增加,尤其是病理性的p-α-Syn蛋白表达有明显的增多,表明rs12411216突变可导致p-α-Syn表达增加。并且,通过凝胶电泳迁移率实验(EMSA)发现rs12411216突变后转录因子E2F4的结合效率明显降低。这些结果表明了该调控区域内的rs12411216显著影响靶基因的表达,证实了该突变是GBA基因表达变化的因果变异。5)为了探究敲除DHS与替换SNP后相关细胞表型的变化,采用酶活性检测发现,相比于野生型细胞,敲除DHS与替换SNP后细胞的GBA酶活性降低;采用细胞免疫荧光检测,观察到在敲除DHS后,细胞内p-α-Syn的异常聚集水平提高了2.13倍;当替换SNP rs12411216后,p-α-Syn的异常聚集提高到了1.52倍。这些结果表明,rs12411216突变可能会导致病理性p-α-Syn的异常聚集,并增加帕金森病的风险。总之,本研究的结果表明位于GBA基因上游40Kb的调节序列中的rs12411216是GBA的调节性SNP,可能成为潜在的PD-MCI分子遗传标记物,且该突变影响GBA表达导致α-突触核蛋白的异常聚集,为帕金森病伴轻度认知障碍的早期诊断和疾病发生的分子机理研究提供新线索。