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目的：手术、放疗、化疗和生物免疫治疗是目前治疗恶性肿瘤的四大主要手段。树突状细胞(Dendritic cell，DC)是肿瘤生物治疗领域的焦点。目前，对DC/肿瘤融合细胞疫苗用于肿瘤治疗已进行了大量的研究，然而由于肿瘤细胞免疫原性低，抗原表达少，导致诱导的杀伤效应不强。甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein，AFP)是目前临床应用最广泛的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)标志物，且被用作肝癌免疫治疗的靶抗原。研究表明，AFP致敏的DC能够诱导出针对AFP阳性肝癌的细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应。高尔基体糖蛋白73(Golgi protein-73，GP73)是近年来发现的最有价值的肝癌标志。本课题组前期研究结果显示，HCC患者血清GP73水平显著升高，GP73诊断HCC的敏感性和特异性显著高于AFP;且免疫组化结果提示肝癌组织可产生大量的GP73，提示其可作为肝癌的分子标记物。为进一步明确GP73能否作为肝癌免疫治疗的靶抗原，联合AFP能否提高肝癌细胞的免疫原性，加强DC/肿瘤融合细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应，本研究利用基因工程技术构建过表达AFP和GP73的肝癌细胞，并将过表达的肝癌细胞与DC在体外利用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)融合，观察DC/肿瘤融合细胞诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤活性。 方法：利用基因工程技术分别构建携带AFP和GP73基因的慢病毒，并通过流式细胞仪筛选AFP和GP73均阴性表达的肝癌细胞株;通过病毒感染预实验确定病毒感染肝癌细胞的最佳条件，在最佳条件下，两种慢病毒分别或共转染筛选的肝癌细胞，利用倒置荧光显微镜观察转染效率;采用RT-PCR和Western blot实验从基因和蛋白水平验证得到的AFPGP73-HepG2、AFP+GP73-HepG2、AFP-GP73+HepG2和AFP+GP73+HepG2四组细胞AFP和GP73的表达;同时以密度梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞，细胞因子诱导培养DC;利用PEG诱导培养的DC与AFP+GP73+HepG2融合;CCK-8试剂盒体外检测融合细胞诱导的CTL对各组肝癌细胞的杀伤活性;荷瘤裸鼠融合疫苗的接种观察融合细胞疫苗体内的抑瘤效果。 结果：筛选得到AFP-GP73-HepG2肝癌细胞，慢病毒构建成功，转染AFP-GP73-HepG2后，通过荧光倒置显微镜观察，显示转染效率均在85％以上，且RT-PCR和Western blot验证AFP在AFP+GP73HepG2和AFP+GP73+HepG2中高表达，GP73在AFP-GP73+HepG2和AFP+GP73+HepG2中高表达，提示转染成功。外周血单个核细胞在细胞因子的作用下能够诱导分化为具有典型树枝状形态的细胞，与AFP+GP73+HepG2融合后高表达CD80、CD86和HLA-DR，表明具有较强的抗原提呈和启动T细胞免疫应答的功能。AFP+GP73+HepG2/DC诱导的CTL在体外对四组肝癌细胞具有杀伤作用，且对AFP+GP73+HepG2组细胞杀伤效应最明显，差异具有统计学意义;荷瘤裸鼠体内实验也证实，融合细胞疫苗对AFP+GP73+HepG2组裸鼠的肿瘤抑制效应最显著。 结论：GP73也可作为肝癌免疫治疗的靶抗原，且与AFP联合可以更显著提高肝癌的免疫原性，加强融合细胞疫苗的抗肿瘤免疫效应，也对解决AFP阴性肝癌的免疫治疗提供了一条新策略。