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漆酶是一类含铜的金属氧化酶，广泛存在于植物、真菌、昆虫和细菌等生物中。在各种生物中，漆酶行使着多种多样、各不相同的作用。同时，漆酶有着广泛的底物谱，漆酶能氧化多种酚类和非酚类底物;另外，漆酶和还原性小分子物质组成漆酶介体系统(laccase mediator system，LMS)以后，能进一步氧化惰性物质和难以进入漆酶底物口袋的大分子聚合物，如染料分子、多环芳香烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)和木质素等。漆酶在氧化底物的过程中以氧气作为最终的电子受体产生水。研究漆酶的电子传递过程以及寻找高效环保的介体物质等成为了漆酶研究的热点问题。 本论文以枯草芽孢杆菌168菌株(Bacillus subtilis strain168)的漆酶CotA为研究对象，探讨了漆酶CotA与芥子酸(sinapic acid, SA)及2，2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2，2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）的相互作用，并对漆酶CotA氧化底物过程中，电子从Ⅰ型铜离子(Type One copper, T1Cu)传递到三核铜离子中心(trinuclear copper center, TNC)的机制进行了深入研究。 论文的第一部分在大肠杆菌（Eschericha coli）DH5α中异源克隆表达了漆酶CotA，综合运用X射线晶体学以及其他方法在三个方面进行了深入研究。 第一，论文解析了CotA/芥子酸复合物晶体结构。在复合物结构中，首次观察到和T1Cu配位的残基His419与底物分子成键，发挥初级电子受体的作用。在底物结合到CotA以后，残基Arg416的侧链残基向底物偏摆10°。通过突变实验验证Arg416在芥子酸以及其他底物的氧化过程中起重要作用。对CotA氧化芥子酸的产物进行分析发现，相比中性条件(pH7.0)，CotA在偏酸条件下(pH5.0)氧化芥子酸得到的产物种类更少，有利于后续有用产物的纯化和制备。 第二，论文解析了漆酶CotA/ABTS复合物晶体结构，发现了一个新的ABTS结合位点。ABTS结合在由结构域Ⅱ和Ⅲ之间连接loop与结构域Ⅲ形成的一个孔洞结构中。通过突变孔洞结构的周边氨基酸后发现，Arg146、Arg429和Arg476等氨基酸不仅在ABTS结合中有作用，因其还紧邻CotA的TNC，所以突变后会极大的影响漆酶的催化活性。比较真菌和细菌的结构域Ⅱ和Ⅲ之间的连接loop发现，相比真菌漆酶，细菌漆酶的连接loop短而松散，有利于形成孔洞结构。但是，进一步分析已发表大肠杆菌(E.coli)漆酶CueO和空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的漆酶的结构发现，空肠弯曲菌漆酶没有类似结构，而CueO有一个较小的类似结构不利于底物结合。通过比较不同菌株的CotA蛋白序列发现，在不同来源的CotA中，都有一段结构域Ⅱ和Ⅲ之间的连接loop区，并且长度相近，组成孔洞结构的氨基酸也有一定的保守性，推测类似孔洞结构可能存在于其他CotA中。 第三，论文研究了CotA漆酶T1Cu到TNC的电子传递机制。将连接T1Cu和TNC之间的氨基酸残基His491和His493突变为丙氨酸或者半胱氨酸，得到了CotA及其突变体蛋白在pH8.0和pH5.8下的蛋白晶体结构。通过比较突变体蛋白与野生型蛋白的活性、晶体结构、UV-Vis光谱以及电子磁共振(electronparamagnetic resonance，EPR)等数据，推测电子应该是经由T1Cu和TNC之间的保守三肽(His-Cys-His)来传递的，而非通过空间进行直接传递。 论文的第二部分在毕赤酵母中异源表达了真菌变色栓菌（Trametesversicolor）漆酶lac3b。在发酵液中，异源表达的lac3b漆酶活力达到1030 U/L，蛋白含量为50-60 mg/L。通过多步骤纯化，得到了三部分分子量有差别的lac3b蛋白。而且经测量三部分样品的比活力也有区别，这种区别可能来源于不同样品之间的分子量差别。进一步采用糖肽酶PNGaseF、内切糖苷酶EndoH以及外切糖苷酶α1-2，3-mannosidase对漆酶lac3b蛋白的糖基化进行分析，发现异源表达的lac3b不仅有N-糖基化糖链，还有大量的O-糖基化糖链。 论文通过研究漆酶CotA漆酶以及CotA/底物复合物晶体结构，进而分析其功能，发现了T1Cu配位残基His419可以作为电子初级受体;发现CotA具有特殊的孔洞结构，可以结合底物分子;结构和功能分析数据显示，电子在T1Cu和TNC间的传递很可能是通过保守三肽的键键传递过程，这些研究结果对于认识细菌漆酶的作用机理具有重要意义。另外，论文构建了真菌漆酶lac3b在毕赤酵母的高效表达系统，为研究真菌漆酶的作用机理奠定了基础。