【摘 要】
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在里氏木霉Rut C-30的基础培养基(Mandels营养液)中加入固定碳源乳糖和槐豆胶,然后将可变碳源(云杉纤维、玉米芯纤维、麦杆纤维、麦杆木聚糖、玉米芯木聚糖、云杉甘露聚糖)进
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在里氏木霉Rut C-30的基础培养基(Mandels营养液)中加入固定碳源乳糖和槐豆胶,然后将可变碳源(云杉纤维、玉米芯纤维、麦杆纤维、麦杆木聚糖、玉米芯木聚糖、云杉甘露聚糖)进行单因子、双因子、三因子、四因子、五因子的里氏木霉Rut C-30正交培养实验,并以槐豆胶为底物用3,5二硝基水杨酸法测定培养液中β—甘露聚糖酶的活力.从而确定了酶活最高且菌体生长良好的含云杉纤维、麦杆木聚糖和云杉甘露聚糖的诱导培养基为最佳培养基,用该培养基培养的里氏木霉(T.reesei)Rut C-30使其转录的β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannan mannohydrolase EC 3.2.1.78)mRNA量能够满足RT-PCR的要求.分取诱导培养液中的菌体,用异硫氰酸胍法提取总RNA,总RNA再经无RNA酶的DNA酶处理后用于RT—PCR.在PCR扩增目的基因时,通过优选扩增体系,使镁离子浓度为1.25mM时RT—PCR可顺利地获得目的基因,并能定向克隆到载体pGEM—3Z(amp)中.用克隆载体转化宿主大肠杆菌JM109,通过筛选获取阳性克隆子,对阳性克隆子进行酶切与PCR鉴定,并对载体中插入的目的基因进行测序.其测序结果与genbank中的里氏木霉Rut C-30β-甘露聚糖酶成熟肽cDNA序列进行序列同源性比较,结果二者序列完全一致.
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