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下腰痛是影响人类生活质量的主要因素之一，在世界范围内有着显著的社会及经济影响。椎间盘退变是引起下腰痛的主要原因。大量研究结果显示椎间盘退变过程中的许多细胞事件都出现了异常，这一变化的背后是椎间盘内特定分子基因的表达失调。在基因表达的过程中各层次调节因素的变化最终都会导致基因的表达失调。在这些因素中，具有调节功能的非编码RNA的异常表达近年来越来越受到学者们的关注。非编码RNA有许多亚类，除了研究较为透彻的microRNA，越来越多的证据显示LncRNA（long noncoding RNA）在机体的很多生物学过程中都发挥着关键的调节作用，此外LncRNA的表达失调还与许多人类疾病的发生有着密切联系。然而到目前为止还没有一项针对椎间盘退变过程中LncRNA表达情况的研究，鉴于此我们进行了本实验，以确定椎间盘退变过程中LncRNA是否会出现异常表达，并对椎间盘退变过程中LncRNA所发挥的功能进行预测和验证。本研究分为三大部分，现将主要研究发现概述如下：第一部分是人髓核组织内LncRNA和mRNA的表达谱研究。在这一部分中我们对10例人髓核组织样本（5例正常样本，5例退变样本）进行了LncRNA-mRNA基因芯片研究。按照标准化处理后LncRNA和mRNA的信号强度，我们将10个样本中至少有5个样本出现表达或模糊表达的LncRNA和mRNA界定为有意义的被发现基因，依据这一标准我们在10例样本内共发现了18995个LncRNA和14635mRNA。随后我们采用箱型图、散点图和聚类分析对这一筛选后的数据进行了质量评估，结果显示正常样本和退变样本的基因表达模式存在显著差异，退变样本内某些基因的表达水平与正常样本明显不同。我们以表达水平变化超过2倍且student t检验P值小于0.05作为差异表达的标准，并对以上数据进行了进一步的筛选。结果发现同正常样本组相比，退变样本组内共有2309个LncRNAs和3017个mRNA存在差异表达，其中1660个LncRNAs表达水平出现上调，649个LncRNAs出现表达下调，2208个mRNAs表达上调，809个mRNAs表达下调。芯片结果显示在筛选出的数千个差异表达的LncRNA和mRNA中，差异表达倍数超过10倍的LncRNA和mRNA的数目分别为164（97个上调，67个下调）和265（140个上调，125个下调）。相比对照组在4例退变样本中表达上调的LncRNA为271个，631个LncRNA在5例退变样本中均出现表达上调，对于表达下调的LncRNA这一数目分别为51（5/5）和147（4/5）。此外我们还发现相比正常组样本，364和672个mRNAs分别在5例退变样本和4例退变样本内出现表达上调，对于表达下调的mRNA，这一数目分别为92（5/5）和251（4/5）。我们还对特殊类型的LncRNA进行了鉴定，在所有髓核组织样本共发现了160个HOX（Human homeobox transcription factors）蛋白编码基因转录本，其中的22个存在差异表达，同时还发现了292个HOX非编码转录本，其中的37个存在差异表达。我们在所有样本中共发现951个E-LncRNA（enhancer-like LncRNA），其中112个出现了差异表达，53个临近的蛋白编码基因同时出现了差异表达，在这53对E-LncRNA及蛋白编码基因中，有32对的差异表达方向一致（同时表达上调或者同时表达下调）。在本实验中我们基于Rinn关于lincRNA（large intervening noncodingRNA）的研究结果对基因芯片数据进行了筛选，在所有样本中共发现了2043个lincRNA，其中的267个存在差异表达，133个lincRNA临近的蛋白编码基因同时存在差异表达。为了验证基因芯片结果的可靠性，我们选取了4条LncRNA，在8例退变髓核组织样本和6例正常髓核组织样本中对其进行了qRT-PCR检测。结果显示qRT-PCR数据与基因芯片结果数据有着很好的一致性，提示本研究中通过基因芯片获得的数据具有很高的可信度。本研究的第二部分是针对退变样本内异常表达的LncRNA和mRNA进行的生物信息学预测研究。在本部分中我们采用了KEGG（the database of Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes）生物学通路、GO（the Gene Ontology project）分析以及DAVID（the database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能注释簇集等生物信息学方法对差异表达的LncRNA和mRNA进行了功能注释和预测。针对差异表达的mRNA进行的KEGG生物学通路分析发现了数个有研究意义的生物学通路，例如Focal adhesion、ECM-receptor interaction、Adherens junction、Ubiquitin mediatedproteolysis、Other glycan degradation、Antigen processing and presentation、TGF-betasignaling pathway等等。对差异表达的mRNA进行的DAVID功能注释簇集分析的结果中出现了细胞外基质、软骨发育、血管发生、凋亡、基因表达的负向调控等术语条目，大量研究结果显示这些病理变化广泛存在于椎间盘退变的过程中。此外我们还对差异表达的lincRNA和E-LncRNA附近的差异表达蛋白编码基因进行了DAVID功能注释簇集分析，结果显示这些差异表达的lincRNA和E-LncRNA主要与蛋白激酶和机体的磷酸化过程有关。根据Pearson相关分析结果，我们针对差异表达最为显著的10个LncRNA及与其存在共表达关系的数百个mRNA构建了CNC（coding-noncoding coexpression）网络关系图。针对共表达的mRNA进行的KEGG生物通路分析结果显示这些mRNA主要与Ribosome和Antigen processing and presentation这两个生物通路有关。此外我们还对这些LncRNA和mRNA进行了GO分析，有趣的是在获得的相关术语条目中涵盖了translational elongation, negative regulation of cellular differentiation, cartilagedevelopment, negative regulation of signal transduction, chondrocyte differentiation,collagen fibril organization, posttranscriptional regulation of gene expression, regulationof apoptosis and proteoglycan metabolic process等术语。本研究的最后一部分是关于椎间盘退变中特定LncRNA及其蛋白编码基因的表达研究。我们选择了两对特殊类型的LncRNA及其蛋白编码基因进行了深入研究。在第一个实验中我们通过qRT-PCR对RP11-296A18.3、FAF1、CASP8在14例髓核样本中的表达水平进行了检测，结果显示RP11-296A18.3、FAF1、CASP8在退变样本内的表达水平明显高于正常样本，这一结果与基因芯片的结果相吻合。活跃表达的FAF1可以显著增强Fas介导的凋亡活动并引起细胞死亡的增加。以往的研究结果显示类似于RP11-296A18.3的E-LncRNA的表达上调可以引起其临近蛋白编码基因的表达增加。退变椎间盘内FAF1的超量表达很有可能是由于其临近的RP11-296A18.3的表达上调所导致，RP11-296A18.3的这一作用会引起退变椎间盘内髓核细胞的过度凋亡并加速椎间盘退变的进程。在第二个实验中，我们通过检测髓核样本中lincRNA-SLC20A1-1、IL-37及其他细胞因子的表达含量，以确定lincRNA-SLC20A1-1和其临近蛋白编码基因的表达水平之间是否存在较强的关联性，及抗炎细胞因子IL37在椎间盘退变过程中所发挥的作用。结果显示相比正常样本，退变样本内lincRNA-SLC20A1-1表达水平显著上调，与此相反IL-37在基因层面和蛋白层面的表达水平均出现了显著下调。lincRNA-SLC20A1-1和IL-37的表达呈现出显著的负相关性。此外在退变样本内还发现了表达上调的IL-1β, IL-16, TNF-α, TGF-β1、Smad3等促炎因子和细胞因子。IL-37和IL-1β, IL-16, TGF-β1, Smad3等促炎因子和细胞因子的表达水平也呈现出显著的负相关性。IL-37的表达下调很可能导致了退变椎间盘内IL-1β和IL-16等促炎因子的表达上调并最终导致了椎间盘退变的进展。我们首次针对椎间盘退变过程中LncRNA的表达进行了研究，并且发现了椎间盘退变的一个新的可能致病因素，后续的研究应着眼于对退变相关LncRNA的更深入探索，以了解特定LncRNA在退变病理机制中发挥的确切作用。对椎间盘退变过程中LncRNA的深入研究，可以帮助我们更好的了解这一病变的详细机制，为未来以LncRNA为切入点治疗椎间盘退变的相关疾病奠定基础。