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第一部分鳞翅目昆虫Cry毒素受体与人类的同名蛋白的生物信息学分析 背景： Cry毒素是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)产生的一种杀虫晶体蛋白，已广泛应用于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等害虫的生物防治。Cry毒素的杀虫机制主要包括细胞穿孔模型和信号转导细胞凋亡模型，虽然两种模型仍有争议，但Cry毒素受体在两种模型中都具有重要的作用[1,2,3]。Cry毒素受体主要有氨肽酶 N（aminopeptidase-N, APN）[4]、类钙黏蛋白（Cadherin-like protein, CaLP）[5]、碱性磷酸酶(alkaline-phosphatase, ALP)[6]和糖脂类[7]。人体同样存在APN、CaLP、ALP三种蛋白，其与鳞翅目昆虫Cry毒素受体的异同以及是否具有Cry毒素受体的功能至今鲜见报道。利用生物信息学技术分析鳞翅目昆虫Cry毒素受体APN、CaLP、ALP与人类的同名蛋白之间的关系，有利于探讨人体内是否存在 Cry毒素受体或类似物，为评价Cry毒素的安全性提供理论依据。 目的： 分析鳞翅目昆虫Cry毒素受体氨肽酶N(APN)、类钙黏蛋白(CaLP)、碱性磷酸酶(ALP)与人类的同名蛋白之间的关系，探讨人体内是否存在Cry毒素受体或类似物。 方法： 从NCBI数据库获取人类和鳞翅目昆虫的APN、CaLP、ALP的氨基酸序列，利用Clustalx1.83、Clustal Omega、MEGA6.0、InterPro、SWISS-MODEL及FATCAT等软件和在线服务器对序列一致性、系统发育关系、结构域、三维结构相似性等进行预测和分析。 结果： APN系统发育关系最近的是人类与家蚕，两者序列一致性最高58.06％、含2个相同的结构域、三维结构相似性显著（62.80%，P﹤0.05），且两者都含有潜在的O糖基化和N糖基化位点。ALP系统发育关系最近的是人类与家蚕，两者序列一致性最高46.03%、含2个相同的结构域、三维结构相似性显著（59.63%和59.59%，P﹤0.05）。人类与鳞翅目昆虫的CaLP系统发育关系较远；CaLP序列一致性最高是人类与棉铃虫（28.12%），两者含2个相同的结构域、三维结构相似性不显著（18.75%， P﹥0.05）。 结论： 人类和家蚕的APN、ALP系统发育关系最近、序列一致性最高、含有相同的结构域且三维结构相似性显著；人类与家蚕的APN均含有潜在的O糖基化和N糖基化位点。因此，预测人类的APN、ALP与家蚕的APN、ALP可能具有相似的生物学功能。由于家蚕的APN、ALP具有Cry毒素受体的生物学功能，因此推测人类的APN、ALP也可能具有类似Cry毒素受体的功能，但仍需进一步实验验证。 第二部 Cry2Aa蛋白的果蝇表达体系构建 背景： 苏云金芽孢杆菌产生的 Cry蛋白对鳞翅目、鞘翅目等昆虫具有杀虫活性，因而被作为有效的生物杀虫剂广泛应用于农林业害虫的防治。随着转基因技术的发展， Cry蛋白在抗虫转基因作物的应用也越来越多，目前国内外已成功培育出转基因玉米、水稻、油菜、棉花等多种抗虫转基因作物。由于外源基因的插入可能会引起次级效应和位置效应，因此转基因作物可能存在一些潜在的风险。目前，转基因作物的食用安全性和生态安全性越来越受关注。其中，转基因作物的过敏原性评价是研究重点之一，而获得一定量的外源蛋白是进行过敏原性评价的基础。另外，我们已经通过生物信息学预测人类的APN和ALP可能具有类似Cry毒素受体的功能，进一步的实验验证需要 Cry蛋白作为实验材料。果蝇表达系统结合了昆虫表达系统和哺乳动物细胞表达系统的优点，减少内毒素的影响，能够直接产生高效且稳定表达外源蛋白的昆虫细胞系，具有较好的应用前景。 目的： 将Cry2Aa基因克隆进果蝇表达载体pAc5.1/V5-His中，构建Cry2Aa-pAc5.1瞬时转染质粒。另外，在Cry2Aa基因的5’端添加一个帽子结构和Kozak序列从而获得C2A33目的基因，并将其克隆进果蝇表达载体pMK33/pMtHy中，构建C2A33-pMK33稳定转染质粒。将这两种重组质粒分别采用瞬时转染和稳定转染的方法转入果蝇S2细胞，从而构建Cry2Aa蛋白的果蝇表达体系。表达的Cry2Aa蛋白可作为评价Cry2Aa蛋白过敏原性及实验验证人类的APN和ALP是否具有Cry毒素受体功能的实验材料。 方法： 1、根据Cry2Aa基因序列和实验要求设计PCR引物，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。 2、PCR扩增获得Cry2Aa目的基因，将其克隆进pEASY–Blunt Simple Cloning Vector并进行菌落PCR和双酶切鉴定；将鉴定正确的目的基因克隆进果蝇表达载体pAc5.1/V5-His中，构建Cry2Aa-pAc5.1瞬时转染质粒，进行菌落PCR、双酶切和测序鉴定。 3、PCR扩增获得C2A33目的基因，将其克隆进pEASY–Blunt Simple Cloning Vector并进行菌落 PCR和双酶切鉴定；将鉴定正确的目的基因克隆进果蝇表达载体pMK33/pMtHy中，构建C2A33-pMK33稳定转染质粒，进行菌落PCR、双酶切和测序鉴定。 结果： 1、构建了Cry2Aa蛋白的瞬时转染质粒Cry2Aa-pAc5.1。 2、构建了Cry2Aa蛋白的稳定转染质粒C2A33-pMK33。 结论： 本研究构建了 Cry2Aa蛋白的瞬时转染质粒 Cry2Aa-pAc5.1和稳定转染质粒C2A33-pMK33，两种重组质粒可分别用于瞬时转染和稳定转染，从而构建 Cry2Aa蛋白的果蝇表达体系。