论文部分内容阅读
食管癌是最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤的第六位。而我国是食管癌的高发区,尤其以太行山周边的河北、河南及山西的部分地区为重。尽管目前临床已采取了一系列的综合治疗手段,但患者平均5年的生存率仍然较低,分析其主要原因是食管癌的转移性。因此,如何降低食管癌转移的发生率,对于改善食管鳞癌病人的临床治疗效果将会有很大帮助。1986年,Liotta等在黑色素瘤细胞株的细胞培养基中发现了一种能够刺激小鼠3T3成纤维细胞运动的蛋白质,命名为自分泌运动因子(autocrine motility factor, AMF)。最近研究发现,AMF与其受体结合后,能够刺激细胞运动。目前在口腔鳞癌、胃癌、乳腺癌及肝癌中均发现了它的异常高表达,且其表达水平与肿瘤的淋巴结转移、血管侵润及肿瘤分期等密切有关。但有关AMF在食管鳞癌细胞中侵润转移的研究尚未见报道。因此本研究的主要目的是构建AMF基因的绿色荧光蛋白载体及真核表达载体,分别转染食管鳞癌细胞株,对AMF基因在食管鳞癌细胞株中的表达进行定位,并对AMF基因在食管鳞癌细胞株发生、发展中的作用进行初步研究,为食管鳞癌细胞株的分子靶向治疗提供理论依据。实验结果表明,在转染pEGFP-C1-AMF后,AMF基因在胞质内有表达,表明AMF基因定位于细胞质。此外,Western blotting检测发现与未转染组及pcDNA3.1(+)空载体转染组相比,转染pcDNA3.1(+)-AMF后食管鳞癌细胞株p-cofilin蛋白的表达明显升高,蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05)。说明AMF基因的引入能够明显促进肿瘤细胞的转移,提示AMF基因有可能成为治疗食管鳞癌的一个潜在的分子靶点。方法1总RNA的提取及鉴定根据Invitrogen公司Trizol试剂说明书从人食管鳞癌细胞株中提取总RNA,并鉴定RNA的浓度、纯度和完整性。提取后用50μl无RNase的水溶解。2 AMF基因的克隆及鉴定根据GenBank上登录的AMF的cDNA全长序列分别设计引物。以提取的总RNA为模板,RT-PCR根据TaKaRa RT-PCR试剂盒说明书进行。将扩增出的PCR产物分别连接到T载体上,测序。测序结果与GenBank上的AMF基因序列进行比对分析。3 AMF基因真核表达载体的构建及鉴定测序鉴定正确的重组质粒用引物对应的酶切位点进行双酶切,回收正确的片段。同样对真核表达载体pcDNA3.1(+)及绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1进行相应的酶切,回收载体片段。用T4 DNA连接酶分别连接上述回收的片段,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,涂板,过夜培养,挑克隆,提质粒,双酶切鉴定。4转染食管鳞癌细胞株EC9706、Eca109和EC-1接种于6孔板中培养,按LipofectamineTM2000转染试剂说明书使用真核表达载体及pEGFP-C1-AMF及pcDNA3.1(+)-AMF进行转染,以未转染的细胞、转染空载体pEGFP-C1和pcDNA3.1(+)的细胞作为阴性对照。5荧光显微镜下观察EGFP-AMF融合蛋白的细胞定位pEGFP-C1-AMF转染EC9706、Eca109和EC-1细胞24 h后,用显微荧光摄像/照相系统观察EGFP-AMF融合蛋白在食管鳞癌细胞中的定位。.6RT-PCR检测应用Trizol试剂提取转染前后细胞总RNA,取2μg总RNA进行逆转录,PCR扩增AMF,以β-actin为内参,每个样本重复3次。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统摄像,Gene Tools软件进行灰度分析并统计学处理。7Western blotting检测蛋白表达用蛋白裂解液分别提取未转染,转染空载体pcDNA3.1(+)和重组载体pcDNA3.1(+)-AMF细胞的蛋白,用Bradford法测定蛋白浓度。使用Western blotting法检测三组食管鳞癌细胞株中AMF和p-cofilin蛋白的表达差异,并用Gene Tools进行蛋白相对表达量灰度值分析。上述实验均分别重复三次。应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05有显著性。结果1总RNA的鉴定提取的总RNA完整性好,无降解,RNA的纯度和完整性符合RT-PCR要求。2RT-PCR的鉴定RT-PCR结果显示,扩增出的特异DNA条带大小约为1700 bp,与预期结果相符。3 AMF基因真核表达载体的鉴定鉴定正确的目的基因与相应表达载体相连后经相应酶切,于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测连接产物,可以分别看到与其长度相符的载体带和目的条带。4 AMF基因的细胞定位将空质粒pEGFP-C1和重组质粒pEGFP-C1-AMF分别转染食管鳞癌细胞EC9706、Eca109和EC-1,24 h后荧光显微镜下观察。转染空质粒pEGFP-C1的细胞,绿色荧光分布于整个细胞,而转染重组质粒pEGFP-C1-AMF的细胞,绿色荧光定位于细胞质。5RT-PCR鉴定RT-PCR结果显示,与对照组相比,pcDNA3.1(+)-AMF转染株中扩增出AMF基因的目的片段量明显增加,证明AMF基因已成功转入EC9706、Eca109和EC-1细胞。6真核表达载体瞬时转染食管鳞癌细胞株Western blotting结果用鼠抗组氨酸标签的抗体作为一抗,山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗进行Western blotting分析,同时用β-actin作阳性对照。结果显示pcDNA3.1(+)-AMF转染株在25-32 KD处有特异条带,证明含有6个组氨酸标签的AMF蛋白已经表达。与未转染的食管鳞癌细胞株相比,转染pcDNA3.1(+)及转染pcDNA3.1(+)-AMF的食管鳞癌细胞株中p-cofilin蛋白的表达均有增加,具有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功克隆了AMF基因片段,通过BLAST分析可知,该基因与GenBank上登录的序列相同；构建包含AMF基因的真核表达载体并转染食管鳞癌细胞；通过绿色荧光蛋白的真核表达载体的转染,证明转入的AMF基因定位于食管鳞癌细胞的细胞质；转染真核表达载体pcDNA-3.1(+)-AMF后,p-cofilin蛋白的表达量明显增加,增强了细胞的运动能力。这为进一步研究其功能奠定了基础。