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虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Z.)为蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum)多年生灌状草本,主要分布于我国中部及南部地区。虎杖以其干燥根和根茎入药,其性微寒,味微苦,具有清热利湿、散瘀定痛、通便解毒、止咳化痰等功效是一味传统中草药。临床上用于治疗肝胆疾病,肺热咳嗽,疮痈肿毒以及烫伤烧伤,急性细菌性痢疾以及各类炎症。其主要成分大黄素(emodin)具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤、降血压和抑制心肌运动的缺血等多种药理作用,因而大黄素含量的高低是判断虎杖药材质量优劣的标志性成分。 由于虎杖有着较大的药用价值,故此引起了广泛的关注。但虎杖的活性成分含量较低,而对有效成分的大量需求导致对虎杖药材资源的过度开发;再加上传统中药使用的是虎杖的根和茎,因而为了获取药用部位,往往要以牺牲植物整株为代价,这就造成了对虎杖药材资源的极大浪费。长此以往势必会破坏植物资源的储备,对生态环境和该物种的生存都带来了很大的威胁。因此急需发展一些新的方法和途径对虎杖药用资源进行更有效、更合理的开发与利用。 本课题运用植物组织培养技术(plants callus culture),利用薄层层析法(thin-layer chromatography,TLC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)和设计正交实验等方法,考察了不同外植体,碳源、氮源的种类和配比,有机添加物的种类及激素的浓度和配比等因素对虎杖愈伤组织生长及其大黄素含量的影响,建立了虎杖愈伤组织的生长曲线(growth curve)并考察了继代次数对虎杖愈伤组织生长及其大黄素合成的影响。通过对虎杖愈伤组织生长和次生代谢产物大黄素合成积累的规律进行的相关研究,其实验结果如下: 1.以MS+6-BA0.2 mg·L-1+KT0.2 mg·L-1+2,4-D0.5 mg·L-1为培养基,分别以虎杖幼嫩的叶片、茎段、叶柄为外植体,通过运用薄层层析法和高效液相色谱法对愈伤组织中所含大黄素进行定性和定量的检测发现:三种外植体均可成功诱导出愈伤组织,且茎段是诱导愈伤组织的良好外植体,不仅诱导率高、诱导时间短并且大黄素的含量也较高。 2.虎杖愈伤组织的生长曲线基本呈S形。在24 d左右,大黄素的含量达到最高峰,此时生物量也处于较高水平,可对愈伤组织进行收获或继代。 3.3 g·L-1的葡萄糖为较理想的碳源,可有效促进虎杖愈伤组织的生长和大黄素含量的积累;当总氮浓度为60 mmol·L-1,且NH4+:NO3-=1:2时,可提高愈伤组织的生物量和大黄素的含量;添加了牛肉膏的培养基可显著促进愈伤组织的生长和大黄素的积累;光照12 h/d有利于愈伤组织生长量和大黄素含量的增加。当6-BA为2.5 mg·L-1,KT为0.2 mg·L-1,2,4-D为0.5 mg·L-1时,可明显提高愈伤组织中大黄素的含量。 4.通过对虎杖第3代至第12代愈伤组织的生长量及大黄素含量的连续测定,其结果表明:从第5代起虎杖愈伤组织的生长量和大黄素的含量基本保持稳定,可对其进行扩大培养。 结论:外植体、碳源和氮源的种类与配比、有机添加物和生长激素的配比对虎杖愈伤组织生长及其大黄素含量的影响均有一定的影响。在实验条件下,以茎段为外植体,3 g·L-1的葡萄糖为碳源,加入0.5 mg·L-12,4-D、2.5 mg·L-16-BA、0.2 mg·L-1KT和200 mg·L-1牛肉膏,在光照12 h/d的条件下,培养25 d对愈伤组织进行收获,可获得较大的愈伤组织生物量和较高大黄素的含量,并在5～12代内,愈伤组织的生长量和次生代谢物的含量均较为稳定。