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第一部分:附睾小体递入m RNAs并翻译蛋白影响精子功能的可能性探索背景与目的:在附睾中,精子可以直接获得由附睾分泌的蛋白,但也有研究证实精子可以自己合成新蛋白。然而,一般认为,精子不在转录新的m RNAs,但仍有利用m RNAs翻译蛋白的能力。我们的前期研究发现,附睾小体中有丰富的m RNAs。因此我们提出附睾小体向精子递入m RNAs并翻译蛋白。本部分研究的目的是体外验证附睾小体向精子递入m RNAs的现象,探索小体m RNAs合成蛋白对精子功能的影响。方法:取8-12周龄的雄性Balb/c小鼠,处死后分离附睾,分别提取附睾小体(EXOs)和附睾尾部精子,进行以下实验:1、将精子与SYTO RNASelect标记的附睾小体(50μg/107精子)共孵育4h,荧光显微镜下观察附睾小体向精子递入m RNAs的情况;2、将附睾尾部精子并用IVF-30调整密度至(2-3)×107/ml,均分为以下四组:未处理组(精子),氯霉素抑制组(精子+CP),共孵育组(精子+EXOs),共孵育抑制组(精子+EXOs+CP),其中附睾小体浓度为50μg/107精子,CP的终浓度为0.1 mg/ml;分别培养1、3、5h后检测四组精子功能,其中包括活率、运动、超活化运动、顶体反应。结果:精子与SYTO RNASelect标记的附睾小体共孵育后,精子中可见绿色荧光;共孵育后四组精子中精子活率、超活化运动、顶体反应无明显差异(p>0.05),而四组精子的活力存在显著差异:共孵育1h后,可能由于附睾小体本身对精子运动对抑制作用,以及氯霉素抑制精子蛋白合成而影响精子功能的作用,共孵育组和共孵育抑制组与未处理组相比,前向运动和总运动明显减弱(p<0.01),而氯霉素抑制组总运动减弱(p<0.05);3h后,氯霉素抑制组和共孵育抑制组与未处理组相比,总活力减弱(p<0.05),且氯霉素抑制组和共孵育抑制组与共孵育组相比,总活力减弱(p<0.05),而共孵育组和对照组相比,精子活力几乎无差异。相对于1h精子活力比对照组差的情况,3h共孵育组活力已经达到了未处理组的水平;5h后,各组之间无明显差异(p>0.05),但是共孵育组与对照组相比活力有增高的趋势。结论:在体外,附睾小体可以向精子递入RNAs,通过抑制蛋白合成实验提示附睾小体m RNAs可能递入到精子中合成蛋白对参与了精子的运动。第二部分:抑制小鼠附睾尾部精子蛋白翻译对于精子功能影响的体内实验背景与目的:附睾是精子成熟的主要场所,附睾分泌多种蛋白质对精子成熟起着关键性作用,因此研究精子成熟过程中基因与蛋白分子调控的新机制具有重要意义。精子可以直接获得由附睾分泌的蛋白,但也有研究证实精子可以自己合成新蛋白,所以探究精子蛋白翻译对于理解精子成熟非常关键。我们前期研究发现,小鼠附睾液游离m RNAs主要存在于附睾小体中,已知小体可以在体细胞间传递m RNAs并翻译蛋白,我们的实验已证明附睾小体可以向精子递入m RNAs,而精子有合成蛋白的能力。因此我们提出假说精子蛋白翻译对于精子功能有影响。本研究通过体内抑制附睾尾部精子蛋白翻译,研究蛋白谱的变化以及对精子功能的影响。方法:取8-12周龄的雄性Balb/c小鼠,麻醉后向小鼠一侧附睾尾部显微注射精子蛋白翻译抑制剂氯霉素(Chloramphenicol,CP,浓度为10μg/μl),对侧注射等量(5μl)PBS作为对照,术后3天后获取小鼠附睾精子,进行以下实验:1、取两侧附睾组织,进行HE染色,比较其形态特征。2、提取总蛋白,通过i TRAQ蛋白组学技术对比两侧附睾精子蛋白表达的差异,特别是CP组表达下调的蛋白,对下调蛋白进行GO、KEGG生物信息学分析;3、比较两侧精子功能的变化,包括精子活力、存活率、超活化运动、顶体反应。结果:对比两组精子功能变化,发现两组精子活力存在显著差异:CP组的精子活力明显低于对照组(p<0.05),而两组精子的存活率、超活化运动、顶体反应无明显差异(p>0.05);注射后显微镜下观察到两侧附睾组织没有明显病理改变;通过i TRAQ我们筛选到了255个氯霉素组精子下调的蛋白,得到了这些蛋白的GO、KEGG注释及富集分析,GO注释分析显示CP组下调蛋白参与的主要生物学过程有生殖过程、发育过程等;参与构成的主要细胞成分为细胞外基质、细胞膜、细胞器等;主要的分子功能为蛋白结合作用、运输作用、催化活性等。GO富集分析显示,参与的主要的生物学过程有:调节wnt信号通路、细胞表面受体信号通路、细胞发育的调节、囊泡靶向等;参与的构成的主要细胞组分有:运输囊泡膜、内吞囊泡腔、高密度脂蛋白颗粒等;主要的分子功能为:磷酸转移酶活性、三价铁结合、生长因子活性、激酶活性、转移酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、镁离子跨膜转运蛋白活性、G蛋白偶联受体激酶活性、转移酶活性、SH3结构域等。对这些蛋白进行KEGG注释分析,找到了差异蛋白可能参与的前20的通路,包括蛋白质加工、内吞作用、核糖体、RNA转运等通路等,还筛选到一些与精子功能相关的蛋白,如Dnaja1、Slc26a8、Catsper1、Catsper3等。结论:抑制附睾尾部精子蛋白合成对精子功能有一定影响,被抑制蛋白主要参与蛋白加工运输、RNA转运等通路,也有些蛋白为精子功能相关蛋白,这些蛋白可能直接或间接影响精子成熟而导致精子功能成熟障碍。