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拟态弧菌可引起水产动物的腹水病,严重危害水产养殖业的健康发展,但目前尚无疫苗用于该病预防。本实验室前期研究已证实外膜蛋白U(OmpU)是拟态弧菌保守性黏附素蛋白之一,该蛋白对实验小鼠的免疫保护率为60％。同时,筛选鉴定出OmpU蛋白的6个免疫优势B细胞模拟表位,但模拟表位串联肽的免疫效应尚不清楚。本研究的总体思路是设计和表达OmpU蛋白模拟表位串联肽,综合评价其免疫效应,以期获得免疫保护效应较OmpU蛋白有所提高的多表位肽。 首先,根据OmpU蛋白模拟表位序列及多表位串联肽设计原则,优化设计模拟表位串联肽。即用AAY(丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸)接头将已鉴定获得的OmpU蛋白6个模拟表位按不同方式串联,应用DNAStarProtean软件分析各种串联方式的可行性,结果发现以C25-AAY-C17-AAY-C60-AAY-C20-AAY-C66-AAY-C24方式排列的多表位肽中各表位间相对独立,抗原性参数较好,为最佳串联方式。将此多表位串联肽序列转化为基因序列,并在基因序列两端添加酶切位点,终止密码子以及替换稀有密码子,形成一个长度为264bp的多表位串联基因(命名为6epis基因),委托生物公司克隆至质粒pMAL-c4X中。 其次,大量制备模拟表位串联肽,为综合评价其免疫效应提供试验材料。应用基因重组技术构建重组表达质粒pET-32a-6epis,转化至E.coliRosetta进行大量诱导表达,进而使用Ni-ChargedResin亲合层析柱纯化重组蛋白His-6EPIS。经SDS-PAGE和Western-blot分析,发现制备的重组蛋白浓度为1.5mg/mL,纯度达到95%,能与兔抗OmpU抗体发生特异性反应,仍保留天然蛋白的抗原性。 最后,以制备的重组模拟表位串联蛋白、重组OmpU蛋白、标签蛋白和灭活菌苗分别免疫实验鱼,通过测定免疫器官中免疫相关基因表达水平、血清抗体产生水平和免疫动物的保护水平,综合评价其免疫效应。结果显示:(1)6EPIS免疫组草鱼头肾和脾脏中IgMmRNA的表达水平具有明显时间依赖性,免疫后3d开始逐渐升高,至28d达到高峰,攻毒后头肾和脾脏中IgMmRNA表达水平迅速上升,分别较免疫前提高28倍和54倍(p<0.01)。OmpU组、灭活菌组和标签蛋白组草鱼免疫后组织中IgMmRNA转录水平的动力学与重组6EPIS组相似,两因素方差分析结果表明:重组6EPIS组头肾和脾脏中IgMmRNA转录整体水平均显著高于重组OmpU组、灭活菌组和His标签蛋白组的头肾和脾脏(p<0.05),而重组OmpU组、灭活菌组和His标签蛋白组的IgMmRNA转录整体水平无显著差异(p>0.05)。(2)草鱼头肾和脾脏中促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)mRNA表达水平于首次免疫和加强免疫后的第1d上调至极显著水平(p<0.001),但攻毒后的表达水平与对照组差异不显著(p>0.05)。重组6EPIS组促炎细胞因子的整体转录水平显著高于重组OmpU组、灭活菌组和标签蛋白组(p<0.01),且重组OmpU组和灭活菌组均显著高于标签蛋白组(p<0.01),但两组之间差异不显著(p>0.05)。(3)免疫草鱼脾脏和头肾中抗炎性细胞因子IL-10mRNA表达水平轻微下调,但在攻毒后,表达水平显著上调(p<0.01),6EPIS组、OmpU组、灭活菌组促炎细胞因子的整体转录水平显著高于标签蛋白组(p<0.01),但是三组之间的差异不显著(p>0.05)。(4)重组模拟表位串联蛋白能够良好诱导鱼体产生特异性抗体,其免疫后28天琼扩效价为1:16,同时,OmpU组和灭活菌组的血清抗体效价为1:4和1:8,标签蛋白组未检测到针对6EPIS和细菌的特异性抗体。(5)免疫后30天,以10LD50拟态弧菌攻击免疫鱼,结果发现重组模拟表位串联蛋白、重组OmpU蛋白及灭活拟态弧菌对草鱼的免疫保护率分别为86.67%、66.67%和76.67%。 综上所述,OmpU蛋白模拟表位串联肽具有良好的诱导免疫应答能力和免疫保护效应,是理想的疫苗侯选抗原。