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多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞克隆性增生的恶性肿瘤，约占造血系统肿瘤的10﹪。应用传统常规化疗的中位生存期为3～4年，大剂量化疗加干细胞移植虽然使其缓解率有所提高，但它仍然是不可治愈的疾病。大部分患者将在数年内复发，以至难治。因此，如何治疗复发难治性MM及提高其疗效是目前临床急需解决的问题。以沙利度胺为代表的新药，基于其抗血管生成活性，在治疗复发难治性多发性骨髓瘤中取得了很好的疗效。因此，针对新生血管生成成为治疗MM的新靶点。
肿瘤新生血管生成在肿瘤的生长、增殖和转移过程中发挥着重要作用。新生血管生成不仅与实体瘤的临床进展和预后相关，研究证实它在血液系统肿瘤如MM中也扮演着一个重要的角色，且骨髓微血管密度(microvessel density，MVD)与疾病进展以及预后密切相关。新生血管生成受多种因素的影响，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是强大的促血管形成因子，它通过与其受体Flt-1(fms-like tyrosine kinase-1，Fit-1)和Flk-1/KDR((fetal liverkinase-1，Flk-1/kinase insert domain-containing receptor,KDR)相结合而发挥其促血管生成的功能。据报道，MM患者高表达VEGF，血清中VEGF水平升高与MM的不良预后相关；尤其重要的是，MM细胞系和MM患者表达FIt-1而不表达Flk-1，而Flt-1同VEGF的亲和力比Flk-1高7～10倍。这些针对VEGF和其受体Flt-1为靶点的研究为治疗肿瘤打下了良好的基础，几种抗VEGF受体的新药如GW654652、PTK787已经证实在体外具有抗MM的活性。可溶性Fit-1(soluble Fit-1，sFlt-1)被认为是一种天然的VEGF抑制剂，sFlt-1在体内天然存在，是内源性表达Fit-1的剪切形式，缺少Fit-1的跨膜部分和胞内部分。sFlt-1同VEGF结合后，不具备酪氨酸激酶的活性，可以抑制VEGF促血管生成的生物学功能。研究证实，sFlt-1的第1-3个lg样区域是与VEGF结合所必需的，且等同于全长sFlt-1与VEGF的结合能力。sFlt-1通过以下两种途径发挥其抗血管生成活性作用：第一，sFlt-1直接与VEGF结合，形成受体配体复合物，但不具有酪氨酸激酶活性；第二，sFlt-1还可与内皮细胞表面的Flt-1和KDR形成异源二聚体，从而阻断下游磷酸化和信号转导而抑制内皮细胞的增殖，最终阻断VEGF的生物学功能。许多研究均证实以sFlt-1为基础的基因治疗具有良好的抑瘤效果，但目前研究多集中于全长sFlt-1及针对实体瘤治疗。
基于以上所述，VEGF及其受体在MM的发生、发展中起着重要的作用。以VEGF和sFlt-1为靶点的治疗在实体瘤及血液系统肿瘤中已取得初步的成效。本研究针对sFlt-1这种天然存在的强大的vEGF抑制剂，体外构建并表达sFlt-1的第1-3个Ig样区域，并将其应用于KM3 MM细胞株和KM3荷瘤裸鼠，探讨其对MM细胞增殖的影响以及可能的作用机制。本研究分为以下四个部分：
(1)VEGF及其受体在多发性骨髓瘤中的表达及其意义采用RT-PCR的方法检测35例MM患者、16例非肿瘤患者及KM3细胞株中VEGF及其受体Fit-1和KDR的表达，并分析表达阳性率以及表达相对水平在MM患者、非肿瘤患者和在MM不同分期间的差异。结果表明：vEGF和Fit-1基因在MM和对照组的表达阳性率分别为62.9﹪vs．18.8﹪和80﹪vs.31.3﹪(P<0.01)，表达水平分别为0.41±019 vs．0.06±0.01(P<0.05)和0.60±0.33vs．0.08±0.03(P<0.01)；VEGF和Fit-1基因在初治组和复发/难治MM组的阳性率分别为66.7﹪vs.60.9﹪和83.3﹪vs.78.3﹪(P>0.05)，在MM Ⅱ期和Ⅲ期的表达阳性率分别为50﹪vs．73.7﹪和81.3﹪vs．78.9﹪(P>0.05)；复发/难治MM组的VEGF和Flt-1基因的表达水平明显高于初治组(0.49±0.20 vs．0.28±0.04和0.70±0.38vs.0.41±0.06，P<0.05)，Ⅲ期MM患者VEGF和Fit-1基因的表达水平明显高于Ⅱ期患者(0.48±0.19 vs．0.28±0.09和0.75±0.35 vs．0.41±0.21，P<0.05)。KDR仅在3例MM患者中检出，对照组未检出。VEGF和Flt-1在MM中高表达，并同疾病的分期相关，可以为MM的病情判断提供一个分子生物学指标。
(2)可溶性Fit-1基因第1-3个Ig样区域的克隆和表达利用RT-PCR的方法从人脐静脉内皮细胞中扩增sFlt-1基因的第1-3个Ig样区域，并将其克隆至TA载体中。构建了包含sFlt-1基因酵母分泌型表达重组质粒pPICZa/sFlt，将pPICZa/sFlt与GS115进行同源重组，得到的转化子经0.5﹪甲醇诱导表达，SDS-PAGE、Western Blot和ELISA方法检测到目的蛋白质sFlt-1的表达；在诱导96 h达到分泌高峰，表达量可达60 mg/L；转化子在摇瓶中扩大培养，表达产物经HIS.Bind亲和层析，得到纯化的sFlt-1，纯度大于90﹪，为进一步研究sFlt-1蛋白的功能提供了基础。
(3)可溶性：Fit-1对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响应用MTT和[<3>H]TdR掺入实验证实：sFlt-1可以抑制VEGF介导的HUvECs增殖和DNA合成，从而证实表达的sFlt-1具有生物学活性；外源性vEGF165以时间-剂量依赖性方式促进KM3细胞增殖；sFlt-1以剂量依赖性方式抑制KM3细胞增殖和细胞DNA合成，并与时间相关，在作用48 h时达到高峰；ELISA实验证实sFlt-1可剂量依赖性的减少KM3细胞vEGF的分泌量；Western Blot实验证实：VEGF可以刺激KM3细胞ERK的激活，使其磷酸化水平升高，从而促进细胞的增殖。sFlt-1可以抑制VEGF介导的KM3细胞ERK的激活。因此，研究认为sFlt-1具有抑制KM3细胞增殖的作用，可能主要通过抑制ERK的激活而抑制细胞的增殖。
(4)腺病毒介导的sFlt-1基因抑制多发性骨髓瘤新生血管生成构建表达sFlt-1的重组腺病毒(ADV-sFlt)，应用Western Blot和ELISA证实sFlt-1的表达，并将其应用于KM3 MM裸鼠。在治疗后3周多发性骨髓瘤裸鼠ADV-sFIt治疗组移植瘤体积为(770.32±28.73)mm<3>，明显小于ADV-Lacz组(1983.36±43.72)mm<3>和PBS组(2042.05±82.31)mm<3>(P<0.01)。每×200倍视野中，ADV-sFlt、ADV-LacZ和PBS组的平均微血管密度分别为29.17±6.85、79.17±7.35和78.83±8.54(P<0.01)。ADV-sFlt可以显著抑制多发性骨髓瘤KM3细胞裸鼠体内生长和抑制瘤内新生血管生成，有望成为治疗多发性骨髓瘤或其它造血系统恶性肿瘤有效的基因治疗方法。综上所述，VEGF和Fit-1在MM中高表达，并与疾病的分期相关，可以为MM的病情判断提供一个分子生物学指标和治疗靶点。针对sFlt-1为内源性强大的VEGF抑制剂，本研究利用毕赤酵母表达系统成功实现了sFlt-1的第1-3个Ig样区域的分泌表达，并将表达产物应用于KM3细胞。体外研究证实sFlt．1具有抑制KM3细胞增殖的作用，可以抑制VEGF介导的KM3细胞ERK的激活，从而证实sFlt-1可能主要通过抑制ERK的激活而抑制细胞的增殖。研究还利用腺病毒表达系统将sFlt-1基因应用于KM3 MM裸鼠，证实sFlt-1具有抑制体内肿瘤生长和肿瘤内新生血管生成的作用。因此，sFlt-1除了通过减少新生血管形成从而抑制肿瘤的生长之外，还同时直接作用于MM细胞，抑制其增殖。这为以sFlt-1为靶点治疗MM提供了理论基础和实验基础，为MM的治疗探索新的途径。