高灵敏生物传感器的研究与应用

来源 :湖南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:simon_sx
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随着基因组计划、蛋白质组学的研究进展,生命科学的迅速发展对分析化学提出了大量的新课题,对多肽、蛋白质、核酸等生物大分子的分析,已成为现代生物分析化学发展的最重要前沿领域之一。蛋白质的定量测定和单碱基突变的确认对人体相关疾病的诊断以及发病机理的研究具有非常重要的意义。 在本研究论文中,主要基于核酸适体技术建立了高灵敏、高特异的检测低浓度蛋白质的荧光免疫分析技术以及利用等位基因PCR原理实现DNA目标链中单碱基突变的检测。具体内容如下: (1)通过抗体/抗原/核酸适体-质粒DNA复合物的特异性识别与双链质粒DNA与荧光染料SYBR Green I的嵌合作用实现血小板衍生增长因子BB(PDGF-BB)的检测。其中,核酸适体-质粒DNA复合物可通过质粒PUC19与PDGF-BB的核酸适体的延伸引物片段杂交制备。生物识别反应在微孔板中进行,PDGF-BB抗原与微孔板底部预包被的PDGF-BB抗体免疫反应后,加入核酸适体-质粒DNA复合物与抗原形成夹心复合物。引入DNA双链染料嵌合SYBR Green I后,抗体/抗原/核酸适体-质粒DNA三元夹心复合物可产生强荧光,其荧光强度可用于定量测定PDGF-BB浓度。此方法成功实现了对人血清中PDGF-BB的定量检测。 (2)发展了一种基于等位基因特异性延伸的电化学检测单碱基突变的方法。通过巯基自组装技术构建传感器界面。当引物与模板完全匹配时,发生等位基因特异性延伸反应,产生二茂铁标记型产物,并形成发夹结构。该产物特异性地与电极上的捕获探针杂交,在电极上出现二茂铁的特征还原峰;峰电流大小与目标链浓度对数成线性关系。而引物末端与模板不匹配时,等位基因特异性延伸反应不能进行,电极上无二茂铁还原峰出现。使用该方法对β-地中海贫血基因的-28位点突变的情况成功地进行了检测。 (3)建立了一种新的纳米金增强伏安免疫分析方法。以人免疫球蛋白G(HIgG)为模型,将羊抗人免疫球蛋白G(GAH IgG)固定于电极表面构成免疫传感器界面。固定化抗体与分析目标物HIgG发生免疫反应而将HIgG捕获,利用夹心法将纳米金标记的GAH IgG结合于电极表面。通过纳米金催化氯金酸还原可在电极表面形成更大的纳米金颗粒,从而大大增加电极表观面积,改善电极表面的电化学吸附行为,再用差示脉冲法对电极进行表征,可实现目标物的高灵敏度定量检测。
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