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牛结核病是主要由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性疾病，在许多国家尤其是发展中国家仍广泛流行，该病不仅给畜牧业造成巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的身心健康。因此，控制牛结核病对防治人类结核病意义重大。然而，至今仍没有一种疫苗可用于该病的预防。本研究利用PCR技术和重叠延伸剪接技术(splice by overlapping extension，SOE)，以牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株的基因组为模板，扩增ag85b、esat-6、hsp65、mpb64基因和ag85b-esat-6、hsp65-esat-6、mpb64-esat-6融合基因，连接到真核表达载体pCDNA3.1(+)中，构建重组质粒pCDNA3.1-Ag85B(简称pCA)、pCDNA3.1．ESAT-6(简称pCE6)、pCDNA3.1-HSP65(简称pCH)、pCDNA3.1-MPB64 (简称pCM)、pCDNA3.1-Ag85B-ESAT-6 (简称pCAE)、pCDNA3.1-HSP65-ESAT-6(简称pCHE)和PCDNA3.1-MPB64-ESAT-6(简称pCME)。转染SP2／0细胞，检测目的基因的表达。以各重组质粒和pCDNA3.1(+)及PBS免疫BALB／c小鼠，免疫3次，每次间隔2周，1免后每周以牛分枝杆菌纯化蛋白衍生物(purified protein derivmive，PPD)为包被抗原，间接ELISA方法检测血清抗体水平；以牛分枝杆菌PPD和刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)为刺激原，MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况。3免2周后以ELISA试剂盒检测脾细胞分泌IFN～γ的情况。结果表明，除pCH组外，其他各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升，与pCDNA3.1(+)对照组和PBS对照组相比差异显著(p＜0.05)。3免2周后，融合DNA疫苗免疫组的刺激值(SI值)与单价DNA疫苗免疫组相比差异显著(p＜0.05)。PPD刺激后融合基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN～γ高于单价DNA疫苗组(p＜0.05)，而ConA刺激后各疫苗组分泌的IFN～γ,水平均高于PPD刺激时(p＜0.05)，其中以pCAE和pCME组最高。以上结果表明在诱导细胞免疫应答方面融合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗。同样，利用PCR和SOE技术，获得牛分枝杆菌mpb64-ag85b和mpb64-ag85b-esat-6融合基因，以pCDNA3.1(+)为载体构建了牛分枝杆菌多价组合和多基因融合DNA疫苗：二基因融合(pCDNA3.1-MPB64-Ag85B，简称pCMA)和三基因融合(pCDNA3.1-MPB64-Ag85B-ESAT-6，简称pCMAE)DNA疫苗；二价组合(pCA+pCM)和三价组合(pCA+pCM+pCE6)DNA疫苗，免疫BALB／c小鼠，以牛分枝杆菌BCG免疫组为阳性对照，以pCDNA3.1(+)及PBS免疫组为阴性对照，共免疫3次，每次间隔2周，BCG组仅初免时皮下免疫1次。1免后每周，以原核表达纯化的重组MPB64-Ag85B-ESAT-6蛋白(rMAE)和牛分枝杆菌PPD为包被抗原，以间接ELISA方法检测血清IgG水平及lgG亚类。每次免疫2周后以rMAE蛋白和PPD刺激，MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况，试剂盒检测IFN～γ和IL-2的分泌情况。3免3周后以1×10~6CFU的BCG进行攻毒。攻毒3周后，以间接免疫荧光试验、肺脏荷菌数和病理组织学变化评价攻毒后的免疫保护效果。试验结果表明，融合DNA疫苗免疫后产生的血清抗体水平、淋巴细胞增值(SI值)水平、IFN～γ和IL-2水平明显高于多价DNA疫苗(p＜0.05)，以rMAE蛋白为包被抗原和刺激原时BCG免疫组的抗体水平、SI值和分泌的IFN～γ、IL-2的量明显低于融合DNA疫苗组，而与多价DNA疫苗组相当，以牛分枝杆菌PPD为包被抗原和刺激原时BCG免疫组的体液和细胞免疫指标均明显优于各DNA疫苗组。从攻毒保护效果来看，融合DNA疫苗组的保护效果明显优于多价DNA疫苗，达到了BCG疫苗的免疫保护水平，表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的用前景，从而为牛结核病新型疫苗的研究奠定了基础。