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山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.),山茱萸科(Cornaceae)山茱萸属多年生木本植物,主要分布于我国陕西秦岭、河南伏牛山和浙江天目山一带,亚洲的朝鲜、日本也有分布。山茱萸干燥果皮是我国传统大宗中药材,具有悠久的药用历史,被历版《药典》收录在册,在补益肝肾、收涩固脱方面有良好疗效。现代药理研究表明,山茱萸具有肝肾保护、神经保护、抗菌等重要生物学活性。目前山茱萸研究主要集中在活性物质分离鉴定、药理作用、种质资源收集和评价与利用等方面,尚缺少山茱萸不同种质药用成分含量差异及其分子机制的深入研究,有关山茱萸果实成熟期以及鲜果采后短期储存后药用成分含量的变化规律也未见报道。本研究选择课题组前期收集的4个山茱萸特异种质(编号HN008、HN009、ZJ026和ZJ030)不同生长时期的果实和叶片为实验材料,首先以酸碱滴定法测定果实和叶片的总有机酸含量,分光光度计法测定总环烯醚萜苷(CIGs)含量,其次采用高效液相色谱法(HPLC)测定莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、山茱萸新苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛(5-HMF)和原儿茶酸等7个环烯醚萜苷类物质含量,综合比较分析山茱萸4个种质总有机酸、总CIGs以及7个环烯醚萜苷类物质含量的变化及差异;最后采用实时荧光定量PCR法测定马钱苷合成通路上G10H(香叶醇-10-脱氢酶)和SLS(裂环马钱苷合成酶)两个关键酶基因表达量,并结合马钱苷和莫诺苷含量进行回归分析,初步揭示山茱萸4个种质的药用成分含量存在差异的分子机制。同时,将采集的山茱萸果实在温度25℃、湿度80%条件下分别放置0d、5d、10d、15d、20d,测定总有机酸、总CIGs以及7个环烯醚萜苷类物质含量,揭示山茱萸果实采后短期储存药用成分含量积累和变化规律。主要研究结果如下:1.山茱萸4个特异种质果实中总有机酸和总CIGs,莫诺苷、马钱苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、獐牙菜苷和山茱萸新苷等药用成分含量存在显著差异(P<0.05)。其中,ZJ030种质中总有机酸(19.25%)和总CIGs含量(16.00%)最高,HN009种质中莫诺苷(2.81%)、马钱苷(1.52%)和山茱萸新苷(0.32%)等物质含量最高。2.4个特异种质叶片中药用成分含量差异显著。结果表明:叶片中总有机酸含量低于果实中,ZJ030种质总有机酸含量最高(7.75%),HN008种质总有机酸含量最低(4.00%);叶片和果实中总CIGs含量相近,4个种质中总CIGs含量差异不显著;叶片中只检测到莫诺苷、马钱苷、原儿茶酸和獐牙菜苷等4种物质,其中除原儿茶酸外,含量均显著低于果实。3.测定山茱萸特异种质7-10月果实和叶片中G10H和SLS基因的相对表达量,结果发现:(1)G10H和SLS基因在果实中的相对表达量高于叶片中的;(2)G10H基因在HN009种质果实中的相对表达量最高(2.398),ZJ030种质最低(0.216),且4个种质在7月和8月的表达量均较高。SLS基因在HN009种质果实中的表达最低(0.444),ZJ030种质最高(0.746);(3)结合基因表达量及莫诺苷、马钱苷含量做回归分析发现,果实中G10H基因表达量同莫诺苷含量之间呈显著正相关(r=0.54,P<0.0001),同马钱苷含量之间呈显著正相关(r=0.70,P<0.0001),SLS基因表达量同马钱苷含量之间呈负相关(r=-0.10,P>0.05)。叶片中各成分含量与基因表达量均没有显著相关性。4.山茱萸果实采后短期储存期间药用成分含量显著增加。总有机酸含量放置15天时达到最高值,总CIGs含量在放置过程中含量显著增加;莫诺苷在放置20天时含量最高;马钱苷在放置10-15天时含量达到最高值,并与采集当日含量具有显著性差异(P<0.05)。综合分析山茱萸9月10日-11月10日各药用物质含量的变化,确定山茱萸鲜果的最佳采收期是9月上旬至10月上旬。上述山茱萸4个特异种质药用成分的综合评价及其揭示差异分子机制的研究,将为山茱英特异种质在新品种选育、高品质中药材生产和种质综合开发利用等方面奠定物质基础。