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IK1（inward rectifier potassium channel）是哺乳动物心脏中具有强大内向整流特性的钾通道。心肌细胞动作电位发生过程中,IK1在稳定静息膜电位和三期复极中起着非常重要的作用。IK1强度减少,可以延长心肌细胞动作电位时程,导致长QT综合征,即Anderson’s syndrome。IK1强度增加,可能导致动作电位时程、有效不应期和QT间期缩短,有效不应期缩短则容易发生快速性的室性心律失常,如室性心动过速和心室颤动等。 IK1通道主要由Kir2家族的同聚体或者异聚体所组成,包括Kir2.1, Kir2.2,Kir2.3和Kir2.4亚单位。心肌细胞中主要含有前三种。近年来诸多研究表明,不同亚单位组装的IK1具有不同的电生理特性,且具有组织特异性和物种依赖性。 胚胎心肌细胞具有自律性动作电位。越来越多的研究表明,胚胎心肌细胞的某些电生理特性与一些病理情况如心肌肥厚和心力衰竭相似,后者可以反演胚胎心肌细胞的某些电生理学特性,因此近年来胚胎心肌细胞的离子通道电生理学特性已经被广泛研究,其中IK1也是一个研究热点。在大鼠、犬、兔、鸡等的胚胎心脏发育过程中,IK1密度呈发育依赖性的增加,但是有关胚胎小鼠心脏IK1的发育性特点研究较少,特别是发育过程中,IK1的电生理学特性及其亚单位基础尚不清楚。因此本研究以小鼠胚胎心室肌细胞为对象,应用钡离子作为阻断剂,采用全细胞膜片钳技术,实时定量PCR, Western blot和免疫荧光双标技术研究不同发育阶段的小鼠IK1电生理学特性及其分子生物学基础。本研究为更好理解胚胎心肌基因以及IK1通道的亚单位组成和物种特异性表达提供进一步认识,为理解和治疗心肌肥厚和心力衰竭等疾病提供理论基础。 一小鼠胚胎心室肌细胞IK1电生理学特性的发育依赖性变化 1.IK1密度发育依赖性增加 方法：采用胶原酶B消化获得单个小鼠胚胎心室肌细胞并培养24-36小时。选择跳动的单个细胞,2mM Ba2+作为阻断剂,以全细胞电压钳模式使用protocol电压（为失活钠通道钳制电位在-40 mV,测试脉冲为-120到+60mV,步阶为10mV,持续时间500 ms）记录心室肌细胞的Ba2+敏感性电流即IK1。分别记录胚胎早期（E10.5）和晚期（E17.5）心室肌细胞的IK1。 结果：含5.4 mM KCl的正常台式液中早期和晚期记录到的IK1均很小,几乎观察不到。100 mM细胞外K+条件下,早期和晚期都可以记录到较大的IK1,符合一般IK1的特点。负于翻转电位时有相对较大的内向电流,正于翻转电位时则有相对较小的外向电流。Ba2+可阻断该电流,经正常外液洗脱后可恢复。早期和晚期心脏的IK1在激活电压-120 mV时均有较大的内向电流,分别为-6.72±1.02 pA/pF（n=9）和-92.29±3.03 pA/pF（n=10）,晚期比早期有显著性增加（P＜0.01）。最大外向电流密度早期为0.60±0.32 pA/pF（n=9）,晚期为3.27±1.11 pA/pF（n=10）,二者有显著性差异（P＜0.05） 2.IK1内向整流特性的发育依赖性增加 方法：采用全细胞膜片钳技术在100 mM细胞外K+条件下记录心室肌细胞的Ba2+敏感性电流即IK1,分别对小鼠胚胎早期和晚期IK1Ⅰ-Ⅴ曲线经Boltzmann方程拟合计算翻转电位数值,Gauss方程拟合计算最大外向电流激活电压,以负于翻转电位30 mV内向电流数值与正于翻转电位20 mV外向电流数值的比值作为公式计算早期和晚期IK1的内向整流率（averaged rectification ratio,RR）,分别对应于-40 mV和+10 mV,即RR=IK1（-40 mV）／IK1（10 mV）,研究比较胚胎早期（E10.5d）和晚期（E17.5d）IK1的内向整流特性。 结果：早期IK1的翻转电位为-11.55±4.55 mV（n=9）,晚期的为-18.41±8.68mV（n=10）,二者没有显著性差别（P＞0.05）。但IK1内向整流特性有明显变化：最大外向电流激活电压早期为22.58±2.42 mV（n=9）,晚期为18.32±0.79mV（n=10）,早期有更加正向的最大外向电流激活电压；平均内向整流率RR晚期（-13.39±1.9,n=9）几乎为早期（3.36±0.92,n=10）的4倍,表明了晚期比早期胚胎小鼠心室肌细胞的IK1有更强大的内向整流特性。 3.IK1激活动力学发育依赖性增快 方法：IK1记录方法同前,电压Protocol（为失活钠通道钳制电位在-40 mV,测试脉冲为-120到-20 mV,步阶为20 mV,持续时间500 ms）,为了更清楚观察胚胎小鼠早期和晚期心室肌细胞的IK1的激活情况,我们选择激活时间在前100ms的电流进行指数方程拟合并计算IK1激活动力学Tau值,研究比较胚胎早期（E10.5）和晚期（E17.5）IK1激活动力学的特点。 结果：在发育过程中,IK1表现了不同的激活动力学特性。早期和晚期IK1均有伪瞬时（pseudoinstantaneous）激活的特性,紧接着是一个比较慢的单指数激活电流。后者经过拟合,早期Tau值（6.14±0.32 ms, n=9）明显大于晚期的Tau值,（0.85±0.14 ms, n=10）,两者具有显著性差异（P＜0.01）。 二小鼠胚胎心室肌细胞IK1通道亚单位的发育依赖性变化 1.不同IK1亚单位mRNA的发育依赖性改变 方法：采用半定量RT-PCR和Real time PCR技术,比较早期（E10.5）和晚期（E17.5）小鼠胚胎心室肌组织Kir2.1, Kir2.2和Kir2.3 mRNA的异同。 结果：早期IK1通道主要表达Kir2.1和Kir2.3亚单位,而晚期主要表达Kir2.1亚单位。Kir2.1亚单位表达呈现发育依赖性增加（n=4, P＜ 0.05 EDS vs. LDS）,而Kir2.3亚单位呈现发育依赖性降低（n=3, P＜ 0.05 EDS vs. LDS）. Kir2.2也被检测到并呈发育依赖性增加（n=3, P＜ 0.05 EDS vs. LDS）,但早期和晚期表达量均相对较低。 2.不同IK1亚单位蛋白水平的发育依赖性改变 方法：采用Western blot和双标免疫荧光技术比较早期（E10.5）和晚期（E17.5）小鼠胚胎心室肌组织Kir2.1和Kir2.3蛋白的表达。因为Kir2.2含量比较少,其功能特性和Kir2.1亚单位的功能特性几乎相似,并且Kir2.1和Kir2.3功能特性相差比较大,因此胚胎早期和晚期Kir2.1和Kir2.3表达决定了IK1通道的电生理作用,我们也由此仅仅研究了Kir2.1和Kir2.3在蛋白水平的表达。 结果：蛋白水平表达的发育性变化与mRNA水平是基本平行的：在早期Kir2.1和Kir2.3均显著表达。随着发育,Kir2.1上调,Kir2.3下调,使得晚期Kir2.1占主导地位。免疫荧光双标结果进一步表明Kir2.1和Kir2.3在小鼠早期和晚期的心室肌细胞中的共定位。 三发育过程中小鼠胚胎心室肌细胞IK1通道的功能性作用 1.胚胎小鼠早期和晚期心室肌细胞不同的动作电位 方法：采用胶原酶B消化分离获得单个小鼠胚胎心室肌细胞并培养24-36小时,应用全细胞电流钳模式记录心室肌细胞的动作电位,应用动作电位分析软件计算观察早期和晚期心室肌细胞动作电位多个基本参数的异同。 结果：早期（n=7）和晚期（n=9）心室肌细胞均有自律性动作电位的发生,但是两个时期动作电位的多个基本参数显著不同,主要表现在动作电位时程（action potential duration, APD）不同和晚期复极速率（velocity of late repolarization phase, Vlrp）不同。早期动作电位时程在90%的复极化（APD90）、50%的复极化（APD50）,20%的复极化（APD20）分别为144.5±7.6 ms、106.3±5.6 ms和59.9±4.5 ms；晚期APD90、APD50和APD20分别为80.3±4.1 ms,60.8±3.8 ms和29.6±3.0 ms,早晚期动作电位时程具有显著差别（P＜0.05）。晚期复极速率在早期（1.40±0.14 V/s）明显慢于晚期（2.0±0.06 V/s）有显著性差别（P＜0.05）。最大舒张电位（maximum diastolic potential, MDP）早期（61.6±1.7 mV）与晚期（63.8±1.1 mV）的差别没有统计学意义（P＞0.05）。 2.IK1通道电流对胚胎小鼠心室肌兴奋性的功能性作用的发育依赖性变化 方法：动作电位记录方法同前,通过比较Ba2+对早期和晚期心室肌动作电位的不同影响,观察Ba2+敏感性电流即IK1对早期和晚期胚胎小鼠心室肌细胞兴奋性的作用。 结果：对早期（n=7）和晚期（n=9）心室肌细胞,2 mM Ba2+均可导致APD90、APD50和APD20的延长,MDP的去极化和V1rp的降低。但是与早期相比,Ba2+对晚期APD90、APD50和APD20的影响更显著（P＜0.05 EDS vs. LDS）。而对早晚期MDP或V1rp作用无显著性差别（P＞0.05 EDS vs. LDS）。 结论： 通过对比早期和晚期胚胎小鼠心室肌细胞IK1的电生理特点和分子生物学基础及其对动作电位的贡献,我们发现 ①与早期相比,晚期胚胎小鼠心室肌细胞上的IK1通道电流密度增加,激活动力学增快,内向整流特性增强。 ②IK1通道电生理学特性发育依赖性变化的分子生物学基础：早期IK1通道亚单位Kir2.1和Kir2.3占主导。随着发育Kir2.1表达上调,Kir2.3表达下调,使得晚期Kir2.1表达占主导。 ③IK1通道的功能性作用在早晚期胚胎小鼠心室肌细胞是不同的,IK1对晚期动作电位时程（APD20, APD50和APD90）的影响比早期的更显著,而对最大舒张电位或复极化速率的影响早期和晚期无明显差别。