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本课题主要围绕促红细胞生成素在糖尿病视网膜病变中的抗炎作用及促红细胞生成素受体在该病患者内皮祖细胞上的表达进行研究,具体包括以下两个方面。
1)促红细胞生成素在糖网病中的抗炎作用
目的越来越多的研究表明,糖尿病视网膜病变(简称糖网病)是一种慢性的低度炎症反应。我们实验室的前期工作表明,眼内注射促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)能保护血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)及视网膜细胞、改善视网膜功能、干预糖网病进程。但是,EPO作用的具体分子机制尚不清楚,本课题在糖网病的细胞及动物模型上研究了EPO对视网膜Müllerl细胞分泌炎症因子的调节作用,旨在验证EPO在糖网病干预中的效果是否与其抗炎作用有关。
方法：在细胞水平上,用不同浓度的乙二醛刺激Müller细胞(rMC-1)12小时,以实时定量PCR的方法检测该细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和VEGF的mRNA表达水平的变化,建立体外炎症反应模型。然后,在乙二醛刺激的同时加入不同剂量的EPO,分别用实时定量PCR及ELISA的方法检测炎症因子在mRNA及蛋白表达水平的变化。此外,用实时定量PCR的方法检测了内源性EPO及EPO受体(EPO receptor,EPOR)的表达变化,用双荧光素酶实验检测了转录因子AP-1和NF-κB的活性变化。在动物模型水平上,利用链脲菌素(streptozocin,STZ)诱导糖尿病大鼠模型,经不同的诱导时间(2周和20周),EPO治疗组给予玻璃体腔注射EPO,对照组及糖尿病组注射等体积生理盐水。24小时后,取视网膜组织,用ELISA的方法检测炎症因子的表达变化,或取眼球固定做冰冻切片,免疫荧光双染实验观察IL-1β与胞内视黄醛结合蛋白(cellular retinaldehyde-binding protein,CRALBP)在视网膜组织中的定位。
结果：在Müller细胞炎症模型中,1 mM的乙二醛刺激,可使炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和VEGF的表达水平上调,而2 U/ml EPO只抑制TNF-α和IL-1β的表达变化,对IL-6和VEGF的表达无明显影响。内源性EPO及EPOR在乙二醛刺激时表达水平均上调,而且EPOR在加入外源性EPO后表达水平进一步上调。转录因子AP-1的活性受乙二醛及EPO的调节,而NF-κB的活性变化不明显。糖尿病大鼠模型上,玻璃体腔注射EPO24小时后,视网膜中TNF-α和IL-1β的表达明显降低,而IL-6和VEGF的表达变化不明显。免疫荧光双染实验显示IL-1β与CRALBP共定位于Müller细胞终足,进一步说明Müller细胞不仅是视网膜中分泌IL-1β的细胞之一,也是EPO发挥抗炎作用的靶细胞之一。
结论：在Müller细胞炎症模型以及STZ诱导的糖尿病大鼠模型上,EPO均能抑制疾病时TNF-α和IL-1β的表达上调,并且可能是通过抑制转录因子AP-1的活性而发挥其抗炎作用的。这些实验结果明确了EPO在视网膜组织细胞中的抗炎作用,并为EPO在临床上用于减轻糖网病中的炎症反应提供了基础理论依据。
2)糖网病患者外周血内皮祖细胞EPOR表达水平的检测
目的由于糖网病发病过程中伴有血管损伤、BRB破环及新生血管形成等复杂的变化,而且循环祖细胞(circulating progenitor cells,CPCs)和内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)与血管修复及新生血管有密切的联系,以及EPO可以通过调节EPCs参与血管修复再生过程,本课题对患不同阶段糖网病的2型糖尿病患者外周血中的CPCs和EPCs上EPOR的表达水平以及血浆中EPO的含量进行了检测,以确定糖尿病患者视网膜中EPO/EPOR系统与血管损伤修复及新生血管的关系。
方法：在正常对照、非增殖性糖网病(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)、增殖性糖网病(proliferative diabetic retinopathy,PDR)、增殖性糖网病合并糖尿病肾病(PDR as well as diabetic nephropathy,PDR-DN)四组受试者中,取空腹外周抗凝血,经红细胞裂解液裂解后,用APC标记抗人CD34单克隆抗体、PE标记抗人KDR单克隆抗体、FITC标记抗人EPOR单克隆抗体标记,流式细胞仪检测了CPCs(CD34+)和EPCs(CD34+KDR+)的数量改变及EPOR在这两群细胞的表达水平。同时用ELISA方法检测了血浆中EPO的含量。
结果：流式细胞术检测结果发现CPCs在NPDR组显著升高而在PDR组显著下降,EPCs在所有糖网病组均下降,而且在NPDR组最明显。血浆中EPO含量在糖网病各组均降低。在NPDR组,EPOR+CPCs、EPOR+EPCs以及这些阳性细胞分别在CPCs和EPCs中占的比例(EPOR+CPCs/CPCs和EPOR+EPCs/EPCs)均显著降低,但在PDR和PDR-DN组中变化不明显。
结论： NPDR息者外周血中EPOR阳性的CPCs和EPCs比例减小,而在PDR患者中这一比例并未降低,提示在NPDR患者应用外源性EPO相对安全,而在PDR患者应用EPO时可能会带来刺激新生血管的副作用。