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第一部分：2型糖尿病大鼠肾脏胆固醇代谢异常背景及目的：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes mellitus, DM)的主要慢性并发症之一,也是终末期肾病(End-stage renal disease, ESRD)最主要的原因,严重影响人们的健康和生活质量。近年来,已有研究证实2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)的动物模型及DN患者的肾脏均存在脂质沉积,并且肾脏的脂质沉积可能与肾功能障碍存在一定的联系。但至今,肾脏脂质沉积的机制仍不完全清晰。因此,本实验的研究目的在于探索T2DM时肾脏脂质沉积的分子机制,以及肾脏脂质沉积能否影响肾脏形态和功能,最终促进DN的发生和发展。方法：SD大鼠适应性喂养1 w后,一部分大鼠维持普通饮食(Normal control, NC),另一部分大鼠给予高脂高糖喂养4 w后,腹腔注射小剂量链脲佐菌素(Streptozocin, STZ,30mg/kg)。72 h后,经尾静脉采血测定随机血糖,以血糖>16.7 mmol/L确定为T2DM模型造模成功。再将成功造模的T2DM大鼠分为糖尿病组(DM)和阿托伐他汀治疗组(10mg/kg/d, DM+AT)。代谢笼收集大鼠24 h尿,检测尿蛋白及尿中性粒细胞明胶酶关联脂质运载蛋白(Urinary neutrophil gelatinase associated lipocalin, u-NGAL).药物干预8 w后,处死各组大鼠并留取血和肾组织标本,检测血清空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)。肌酐(Creatinine, Cr)、尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)、总甘油三酯(Total triglycerides, TG)、总胆固醇(Total cholesterol, TC)和低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)，一部分’肾组织制作冰冻切片用于油红O染色,另一部分肾组织制作石蜡切片用于苏木精-伊红染色(HE染色)、过碘酸雪夫染色(PAS染色)及马松染色(Masson染色)。剩余肾组织用于定量Real-time PCR和Western blot检测肾组织3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaric acyl coenzyme A reductase, HMG-CoAR)、低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor, LDLr)、固醇元件结合蛋白-2(Sterol regulatory element binding proteins-2, SREBP-2)及其裂解蛋白(SREBP cleavage activating protein, SCAP)的基因和蛋白表达。结果：1.DM组大鼠的体重明显低于NC组大鼠(P<0.05),肾重／体重(KW/WT)高于NC组大鼠(P<0.05),FBG也显著高于对照组(P<0.05),并且血脂,包括TG、TC和LDL也比NC组大鼠显著增高(P<0.05)。AT治疗8 w后,与DM组相比,DM+AT组大鼠的体重、KW/WT和FBG改变不明显(P>0.05)；血TC和LDL明显低于DM组(P<0.05),但TG改变不明显(P>0.05)。2.与NC组相比,DM组大鼠的Cr及BUN明显增高(P<0.05)。而DM+AT组大鼠的血清Cr与DM组相比明显降低(P<0.05),两组的BUN差异并不显著(P>0.05)。在0w、2w、4w、8w时,DM组大鼠的尿蛋白比NC组大鼠的尿蛋白水平高(P<0.05)。并且,随着时间的延长,DM组大鼠的尿蛋白呈现不断增加的趋势(P<0.05)。AT治疗2 w、4 w和8 w后,DM+AT组的24 h尿蛋白比同期DM组的24 h尿蛋白低,并且差异均有统计学意义(P<0.05)。第8 w时,DM组大鼠的u-NGAL明显高于NC组(P<0.05)。而AT治疗后,与DM组大鼠相比,DM+AT组大鼠的24 h尿u-NGAL明显降低(P<0.05)。3.HE染色显示,DM组大鼠肾脏出现空泡细胞,尤其在是肾小管上皮细胞,空泡现象比较明显,而NC组大鼠的肾脏细胞并未发现空泡变性。进一步油红O染色发现,大量被染成橘红色的脂滴沉积于肾脏,肾小管上皮细胞沉积尤为明显,肾小球也存在脂质沉积,而对照组大鼠的肾脏未发现脂滴的形成。与此相比,DM+AT组只有少量的脂滴沉积于肾脏。PAS染色显示DM组大鼠肾小球系膜基质增生明显,PASM染色显示DM组大鼠的肾小球及肾小管基底膜均明显增厚,而在NC组大鼠的肾组织未有发现系膜基质增生及基底膜增厚的病理改变。AT治疗8 w后,DM+AT组大鼠的肾小球系膜基质增生、肾小球及肾小管基底膜增厚明显改善。4. Real-time PCR和Western blot结果显示,与NC组相比,DM组大鼠肾脏组织HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2、SCAP的mRNA和蛋白表达明显高于NC组(P<0.05)。AT治疗8 w后,与DM组相比,DM+AT组大鼠肾脏组织HMG-CoAR、LDLr和SREBP-2的mRNA和蛋白表达明显增高(P<0.05),而SCAP的mRNA和蛋白表达改变不明P>0.05)。结论：1.T2DM大鼠肾脏存在脂质沉积,而减少肾脏脂质沉积可以明显改善肾脏组织形态及功能。2.T2DM大鼠肾脏SCAP-SREBP-2-HMG-CoAR/LDLr胆固醇负反馈调节通路紊乱,这可能与其肾脏脂质沉积(肾脏实质细胞泡沫化)有关。第二部分：糖基化终产物介导肾脏胆固醇代谢紊乱背景及目的：DN病因复杂,发病机制众多,其中慢性高血糖引起的糖基化终产物(Advanced glycation end products, AGEs)加速形成是DN的重要发病机制之一。AGEs大量沉积是DM时动脉粥样硬化的泡沫细胞及脂肪肝形成的重要原因。因此,在第一部分研究结果的基础上,本研究将进一步探索AGEs是否能够引起T2DM时。肾脏泡沫细胞形成,从而影响。肾脏的形态和功能,最终导致DN。方法：体内实验：将成功造模的T2DM大鼠分为糖尿病组(DM)和氨基胍治疗组(100 mg/kg/d, DM+AG)。代谢笼收集大鼠24 h尿,检测尿蛋白及u-NGAL。药物干预8 w后,处死各组大鼠并留取血和肾组织标本,检测血清羧甲基赖氨酸(Carboxy-methyl-lysine, CML)。一部分肾组织制作冰冻切片用于油红O染色,另一部分肾组织制作石蜡切片用于PAS染色、Masson染色及免疫组化。剩余肾组织用于定量Real-time PCR和Western blot检测肾组织HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2及SCAP的基因和蛋白表达。体外实验：将人肾近曲小管细胞系(Human renal proximal tubule cells, HK-2)按照不同干预条件分为6组,分别为Ctr组、CML组(给予50 μg/mL CML)、CML+anti-RAGE组(给予50 μg/mL CML和10 μg/mL anti-RAGE)、LDL组(给予50 μg/mL LDL)、 CML+LDL组(给予50 μg/mL CML和50 μg/mL LDL)、CML+anti-RAGE+LDL组(给予50 μg/mL CML.10 μg/mL anti-RAGE和50 μg/mL LDL)。干预24 h后,油红O染色检测细胞内脂质沉积情况,酶学方法检测HK-2细胞内胆固醇酯(Cholesteryl ester, CE)的水平,Real-time PCR和Western blot检测HK-2细胞}IMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的基因和蛋白表达,用转染pEGFP-SCAP的HK-2细胞和抗高尔基抗体染色后,应用激光共聚焦显微镜观察细胞SCAP-SREBP复合物在内质网和高尔基体的定位。结果：体内实验：1.与NC组相比,DM组大鼠血清CML水平明显增高(P<0.05),而DM+AG组大鼠的血清CML明显低于DM组(P<0.05)。并且,免疫组化结果显示,与NC组相比,DM组肾脏的肾小管、。肾小球、肾小球系膜、基底膜及肾间质均有CML沉积,但AG干预8w后,与DM组相比,DM+AG组CML沉积明显减少。2.油红O染色结果显示,与DM组相比,DM+AG组大鼠肾脏脂质沉积减少。3.实验起初,DM组与DM+AG组的24 h尿蛋白总量没有明显差异(P>0.05)。AG干预4 w后,与DM组相比,DM+AG组的24 h尿蛋白总量明显下降(P<0.05)。AG继续干预8 w后,DM+AG组的24 h尿蛋白总量仍然比同期DM组的24 h尿蛋白总量低(P<0.05)。AG干预8w后,DM+AG大鼠的24 h尿u-NGAL含量也明显降低(P<0.05)。PAS和PASM染色结果显示,与DM组相比,DM+AG组大鼠的肾小球系膜基质增生、肾小球及肾小管基底膜增厚明显改善。4. Real-time PCR和Western blot结果显示,DM+AG组大鼠肾脏组织HMG-CoAR、LDLr、 SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表达也明显比DM组低(P<0.05)。体外实验：1.与Ctr组相比,CML组CE值显著增加(36.66±11.55 μmol/L vs.110.00±21.79 μmol/L,P<0.05)；与CML组相比,CML+anti-RAGE组的CE值显著降低(110.00±21.79μmol/L vs.61.67±18.93 μmol/L, P<0.05); CML+LDL组与LDL组相比CE显著增加(111.67±18.93 μmol/L vs.150.00±10.00 μmol/L, P<0.05); CML+anti-RAGE+LDL组与CML+LDL组相比CE值显著降低(150.00±10.00 μmol/L vs.83.33±15.28 μmol/L, P<0.05)。油红O染色结果显示当细胞培养基中仅有50 μg/mL CML或100μg/mL LDL存在时,细胞内有少许红染脂滴存在,当同时有CML和LDL存在时,细胞内的红染脂滴显著增多,而anti-RAGE可以明显抑制CML引起的HK-2细胞内脂滴的增多。2. Real-time PCR和Western blot结果显示,CML组HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表达明显比Ctr组高(P<0.05),而CML+anti-RAGE组HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表达明显比CML组降低(P<0.05); LDL组与Ctr组相比,HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA明显降低(P<0.05)；在高脂状态下,CML+LDL组与LDL组相比,HMG-CoAR、 LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表达明显增高(P<0.05),而CML+anti-RAGE+LDL组HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表达明显比CML+LDL组低(P<0.05)。3.激光共聚焦结果显示,与Ctr组相比,CML组SCAP从内质网向高尔基体的移位显著增加,而CML+anti-RAGE组SCAP的移位与CML组相比明显降低；LDL组细胞内胆固醇处于较高水平,HK-2细胞内SCAP从内质网向高尔基体移位与Ctr组相比明显减少；CML+LDL组可观察到CML明显促进高脂状态下的HK-2细胞SCAP从内质网向高尔基体移位,而CML+anti-RAGE+LDL组SCAP从内质网向高尔基体的移位与CML+LDL组相比显著减少。结论：1.T2DM时,肾小管上皮细胞泡沫化,SCAP-SREBP-2-HMG-CoAR/LDLr胆固醇负反馈调节通路紊乱,与体内高CML水平有关,这可能是肾脏形态及功能损伤的原因。2.抑制AGEs (CML)的合成或阻断CML-RAGE通路,能够减少肾小管上皮细胞脂质沉积,改善肾脏形态及功能。第三部分：糖基化终产物通过内质网应激致肾小管上皮细胞胆固醇代谢紊乱背景及目的：某些病理条件,包括高AGEs水平,能够干扰内质网的正常生理功能,诱发细胞内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)。而ERS能够引起细胞内胆固醇代谢紊乱,从而导致细胞脂质沉积,但其具体机制仍不完全清晰。研究表明,SCAP和SREBP-2都是重要的内质网蛋白,因此,在第二部分研究结果的基础上,本实验将进一步于探究AGEs能否通过触发肾小管上皮细胞ERS,从而引起SCAP和SREBP-2的表达及功能障碍,最终导致肾小管上皮细胞脂质沉积。方法：将HK-2细胞按照不同干预条件分为4组,分别为Ctr组、CML组(给予50 μg/mL CML)、 CML+4-PBA组(给予50 μg/mL CML和5 mmol/L 4-PBA)、4-PBA组(给予5 mmol/L 4-PBA)。干预24 h后,用CCK-8试剂盒和Annexin V-FITC试剂盒分别检测HK-2细胞活力和凋亡情况,油红O染色检测细胞内脂质沉积情况,酶学方法检测HK-2细胞内CE的水平,Real-time PCR和Western blot检测HK-2细胞HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2、SCAP、葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78,GRP78)及C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)的基因和蛋白表达。结果：1.CML干预HK-2细胞24 h后,与Ctr组比较,CML组细胞活力下降(P<0.05),而CML+4-PBA组较CML组细胞活力有所增加(P<0.05)；单用4-PBA干预HK-2细胞24 h后,与Ctr组比较,细胞活力改变不明显(P>0.05)。CML干预HK-2细胞24h后,HK-2细胞凋亡数量较Ctr组有所增加(P<0.05),而CML+4-PBA组较CML组细胞凋亡减少(P<0.05)；单用4-PBA干预HK-2细胞24 h后,与Ctr组比较,细胞凋亡不明显(P>0.05)。2.与Ctr组相比,CML组CE值显著增加(53.33±11.55 μmol/L vs.116.67±32.15 μmol/L, P<0.05); CML+4-PBA组与CML组相比CE值显著降低(116.67±32.15 μmol/L vs.53.33±5.77, P<0.05);与Ctr组相比,4-PBA组的CE改变不明显(53.33 ±11.55 μmol/L vs.53.33±5.77 μmol/L, P>0.05)。油红O染色结果显示有CML存在时,细胞内的红染脂滴显著增多,而CML+4-PBA组的红染脂滴明显比CML组减少；4-PBA组的HK-2细胞内并未发现红染脂滴。3. Real-time PCR和1Western blot结果显示,CML组HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表达明显比Ctr组高(P<0.05),而CML+4-PBA组HMG-CoAR、 LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA和蛋白表达明显比CML组低(P<0.05); 4-PBA组与Ctr组相比HMG-CoAR、LDLr、SREBP-2和SCAP的mRNA口蛋白表达没有明显改变(P>0.05)。CML组GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达明显比Ctr组高(P<0.05),而CML+4-PBA组GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达明显比CML组低(P<0.05); 4-PBA组与Ctr组相比GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达没有明显改变(P>0.05)。结论：1.肾小管上皮细胞泡沫化,SCAP-SREBP-2-HMG-CoAR/LDLr胆固醇负反馈调节通路紊乱,这可能是由CML触发肾小管上皮细胞ERS有关。2.而抑制ERS可以明显改善CML引起的胆固醇负反馈调节通路的紊乱,从而减少肾小管上皮细胞脂质沉积。总结：T2DM时,体内增多的AGEs (CML)可能通过触发肾小管上皮细胞ERS,造成SCAP和SREBP-2表达增加、SCAP功能紊乱,使更多的SREBP-2被运载到高尔基体,水解激活,从而上调HMG-CoAR和LDLr的表达,使肾小管上皮细胞合成和吸收胆固醇增多,肾脏脂质沉积,最终损伤肾脏形态及功能,导致DN。而抑制T2DM时AGEs (CML)的合成或阻断其作用通路能够减少T2DM时肾脏脂质沉积,改善肾脏形态及功能。