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蜕皮贯穿于中华绒螯蟹整个生命周期，与其生长、发育、繁殖等环节密切相关。近年来随着养殖规模的日益扩大，水域生境的不断恶化，导致中华绒螯蟹同步化蜕皮趋势不明显，蜕皮周期时间延长，蜕皮增长率下降，蜕皮死亡率上升，性早熟比例增大等问题日益突出，成为制约着中华绒螯蟹产业可持续发展的重要瓶颈。为此，本研究以中华绒螯蟹的蜕皮生长为切入点，通过比较生态因子对蜕皮增长率与蜕皮周期时间的影响，构建中华绒螯蟹非连续性蜕皮生长曲线;同时比较不同蜕皮时期的转录组表达差异，分析外骨骼几丁质代谢酶基因在不同组织、不同发育阶段的表达特征，研究几丁质代谢酶基因在蜕皮周期过程中的功能作用，从而为中华绒螯蟹渔业养殖生产与自然群体资源动态评估提供科学依据。 1、中华绒螯蟹蜕皮生长特征研究 于2013年3月至8月在实验室内对100只中华绒螯蟹进行连续观察，跟踪测定中华绒螯蟹蜕皮前后的头胸甲与体重的增长率，比较中华绒螯蟹四次蜕皮的蜕皮增长率与蜕皮周期时间变化趋势。结果表明:头胸甲宽的变化范围在15.0-54.5mm;头胸甲宽绝对增长率在1.7-7.9mm之间，平均绝对增长率为4.9±1.4mm;头胸甲宽蜕皮相对增长率在5.3％-39.9％之间，平均蜕皮相对增长率为18.2±6.3％。蜕皮绝对增重率在0-28.46g之间，蜕皮相对增重率在0％-97.5％之间，平均相对增重率在45.2±19.9％;蜕皮周期时间在18-64天之间，平均蜕皮周期时间为40.5±9.5天。根据蜕皮前与蜕皮后壳长、壳宽和体重的相关性建立了定量描述中华绒螯蟹蜕皮生长曲线并分析了其生长特征。 2、温度对中华绒螯蟹蜕皮生长的影响研究 温度是影响水生甲壳类蜕皮生长的关键驱动因子。于2013年1月至5月在实验室内对不同温度条件下120只中华绒螯蟹进行连续跟踪测定，通过比较15℃、20℃、25℃、30℃温度条件下中华绒螯蟹的蜕皮增长率与蜕皮周期时间的变化，分析生态因子温度对中华绒螯蟹蜕皮生长的影响。实验结果表明:15℃、20℃、25℃、30℃温度条件下，中华绒螯蟹壳长相对增长率分别为12.4±4.9％、15.4±4.6％、13.8±4.2％和16.0±5.3％，壳宽相对增长率分别为10.6±4.2％、16.2±3.6％、14.8±4.1％、15.6±5.0％，体重相对增长率分别为22.4±8.73％、42.3±18.20％、33.7±17.01％、43.4±22.25％;平均蜕皮周期时间分别为87.6±21.0、35.6±11.9、25.0±10.0、25.7±8.4天。其中15℃条件下中华绒螯蟹蜕皮相对增长率显著低于其它温度条件下的蜕皮相对增长率;而蜕皮周期时间随着温度的升高而降低。 3、饵料对中华绒螯蟹蜕皮生长的影响研究 饵料是水生甲壳类进行能量储备，顺利完成蜕皮生长的的物质基础。于2014年3月至10月对（人工配合饲料70％+动物性饵料30％）、（人工配合饲料50％+动物性饵料50％）、（人工配合饲料30％+动物性饵料70％）三种不同饵料投喂模式下中华绒螯蟹的体长、体宽和体重进行测量分析，比较不同饵料投喂模式下中华绒螯蟹的生长趋势。在三种不同饵料投喂模式下，中华绒螯蟹平均壳长分别为53.4±2.9mm、54.7±4.0mm、55.0±4.1mm，平均壳宽分别为55.9±3.0mm、58.6±4.6mm、58.6±4.9mm，平均体重分别为97.60±20.19g、105.94±27.77g、112.08±30.16g。实验结果表明:在不同饵料投喂模式下，动物性饵料比例的增加能够促进中华绒螯蟹头胸甲与体重的增大。 4、中华绒螯蟹不同蜕皮时期转录组比较与分析 采用Illumina Hiseq测序平台对中华绒螯蟹蜕皮周期的三个时期(D、A、C)的cDNA样本进行高通量测序，共获得102538条单基因序列，序列长度范围在201-22328bp之间，序列平均长度为622bp。将拼接得到的unigene与NR，Swissprot、KEGG等数据库进行比对，共有17.99％unigene获得注释。通过对中华绒螯蟹三个蜕皮时期(D、A、C)的转录组表达差异基因进行筛选，获得不同蜕皮时期差异基因集。中华绒螯蟹蜕皮前期(D)与蜕皮后期(A)之间有3327个差异表达基因，其中有1486上调基因，1841个下调基因;蜕皮后期(A)与蜕皮间期(C)之间有3586个差异表达基因，其中有2114个上调基因，1472个下调基因。从差异表达的基因集中鉴别出大量几丁质代谢酶基因，发现与表皮硬化相关的表皮蛋白基因及其调控因子，获得了大量与蜕皮生长相关的候选基因，对后续深入开展蜕皮调控机制研究具有重要意义。 5、中华绒螯蟹几丁质酶基因家族的克隆与功能研究 几丁质酶类是水解外骨骼几丁质的关键酶类。通过搜索比对中华绒螯蟹转录组数据库，获得5条与几丁质酶高度相似的序列片段，采用RACE方法扩增获得了5个几丁质酶基因（EsCht1、EsCht2、EsCht3、EsCht4与EsCht6）的序列全长。对几丁质酶基因(EsChts)的蛋白序列结构进行预测，结果表明中华绒螯蟹几丁质酶基因具有典型18家族几丁质酶特征，包括信号肽，催化区、几丁质结合区以及连接区。通过同源性比对发现，EsChts可分为5类，其中EsCht1归属一类，主要与几丁质营养物质的分解有关;EsCht2主要在外表皮与眼柄组织中表达，与外表皮几丁质的分解以及幼体发育有关;EsCht3具有消化几丁质类食物和参加病害侵袭防御的功能;EsCht4和EsCht6都在卵巢组织中高表达，表明它们可能参与繁殖蜕皮。几丁质酶基因在不同发育阶段、不同蜕皮时期的差异表达说明他们具有多种不同的生物学功能。 6、中华绒螯蟹几丁质合成酶基因的克隆与功能研究 几丁质合成酶是催化几丁质链延长的关键酶类。通过转录组测序分析与PCR扩增验证，获得了中华绒螯蟹几丁质合成酶基因(EsCS) cDNA全序列。EsCS序列全长为5874bp，其中ORF框为4725bp，5UTR127bp，3UTR1022bp，编码1574个氨基酸，包含9个跨膜结构的N末端区域，催化区，1个螺旋区域的C末端区域。系统进化分析表明:几丁质合成酶基因首先与甲壳类聚为一类，然后再与昆虫几丁质合成酶1类相聚，最后与昆虫几丁质合成酶2类。EsCS在外表皮、卵巢以及肝胰脏组织内大量表达，其它组织中只有微量或不表达。通过RT-PCR检测发现:EsCS在蜕皮前期(D1-2、D3-4)表达升高，进入到蜕皮后期(A、B)达到峰值，进入到蜕皮间期(C)表达回落到最低水平。本研究为进一步深入研究几丁质合成酶基因在蜕皮生长过程的功能与作用奠定了基础。