论文部分内容阅读
目的:膀胱癌是最常见的泌尿系统癌症,每年新发病例以及死亡病例在不断上升。膀胱癌的诊断主要是基于膀胱与尿路细胞学的检查,因诊断的敏感度较低,因此许多患者在患癌早期难以察觉。从基因水平探索基因表达变化与膀胱癌发生发展的关系可能会为膀胱癌诊断以及开发靶向药物提供新的方向,为寻找非侵入性,敏感性和特异性高的检查方法提供新思路。蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase,PRMTs)参与生物体的多项生理进程。PRMT5具有保守的甲基转移酶催化结构,在多种类型的细胞中广泛存在,而在不同的细胞中其含量水平又不尽相同。PRMT5催化的甲基化修饰在许多细胞中都发挥重要作用,其异常表达影响多种类型恶性肿瘤的发展。PRMT5发挥其生物学功能主要的方式有两种,其一是表观遗传调控靶基因的表达。其二是通过甲基化作用,直接修饰细胞中关键的信号分子。本次研究我们将探究PRMT5在膀胱肿瘤中的表达模式及临床病理意义。并分别通过体内外实验分析PRMT5表达水平变化对膀胱癌产生的影响及其潜在的分子机制。研究方法:1.免疫组织化学:80例膀胱癌组织(病理类型为移行细胞癌)以及10例癌旁正常组织取自于2016-2017年在中国医科大学第四临床学院进行膀胱癌手术切除的患者。将样本进行石蜡包埋并切片备用。本实验用PRMT5为一抗,生物素酶标记二抗,孵育结束后使用DAB显色试剂盒显色,分析PRMT5在膀胱癌组织中的表达模式。2.实时定量PCR:使用RNeasy Mini kit试剂盒提取样本总RNA,SuperScript III First-Strand Synthesis Kit试剂盒进行反转录获取cDNA,SYBR Green MasterMix进行实时定量PCR荧光信号采集。PCR所用仪器为ABI7500。基因相对表达量的测算参照2-ΔΔCt方法,GAPDH为内参基因。3.细胞培养:本实验所用细胞系为:人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1、人膀胱平滑肌细胞HBSMC、人膀胱癌细胞系T24、UM-UC-3、BIU-87、J82、RT4以及5637,培养基为含有10%胎牛血清的DMEM和PRIM-1640培养基。培养条件为37℃,5%CO2,饱和湿度恒温培养。4.蛋白质免疫印迹实验:样本总蛋白经过SDS-PAGE进行分离,并转印于PVDF膜上。本实验所用一抗为PRMT5、Cleaved-Caspase3、GAPDH,孵育条件为4℃过夜。本实验所用二抗为辣根过氧化物酶耦合的二抗,37℃孵育2小时。采用ECL发光液进行发光。5.细胞转染及干扰:PRMT5 shRNA购于Dharmacon,使用Lipofectamine and plus reagent试剂盒进行慢病毒稳转,Puromycin进行细胞筛选。PRMT5 siRNA购于Dharmacon,使用Lipofectamine RNAi MAX reagent试剂盒进行siRNA转染。PRMT5 plasmid购于Origene公司,使用Lipofectamine 3000进行细胞转染实验。6.细胞增殖实验:将经过PRMT5转染以及干扰的细胞悬液(1×106)接种于培养板。分别于第2和4天对细胞进行计数。分析PRMT5表达水平对细胞增殖的影响。接种的细胞悬液连续培养14天,对细胞集落进行计数,分析PRMT5表达差异对集落形成的影响。7.细胞凋亡:收集经过PRMT5转染以及干扰的细胞,加入AnnexinV-FITC以及PI染色试剂室温避光孵育15分钟。流式细胞仪检测细胞凋亡水平变化。8.线粒体膜电位变化:收集经过转染和干扰的细胞,对照组加入CCCP预染5分钟,接着加入JC-1染料,37℃,5%CO2恒温恒湿孵育45分钟。流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化。9.荧光素酶检测:膀胱癌细胞系T24中分别转染control和shPRMT5。膀胱癌细胞系T24使用EPZ015666处理,并进行p5XIP10转染,转染试剂为Lipofectamine and Plus Reagents。48小时后检测细胞中NF-κB荧光强度差异。10.染色质免疫共沉淀:使用truChIP Chromatin Shearing Kit试剂盒制备染色质,并使用Covaris S2高性能样品处理系统instrumen将染色质剪切为200-到700-的片段。免疫沉淀反应使用抗体为IgG和NF-κB p65,使用试剂盒为Quick Chip Kit。ABI SYBR Green MasterMix试剂盒用于PCR荧光信号采集。11.小鼠膀胱肿瘤模型构建:T24细胞悬液(1×106)于C57BL/6J小鼠右前肢腋窝部位皮下缓慢注射。肿瘤长出以后,每隔3天测一次瘤体的重量,计算肿瘤的体积。肿瘤细胞接种后的14天,实验组用EPZ015566(50mg/kg)灌胃,对照组用等体积PBS灌胃。小鼠连续培养4周后,剥离肿瘤,称重。绘制肿瘤生长曲线。获取肿瘤组织,实时荧光定量PCR检测BCLXL,c-IAP1的表达量。12.统计分析:统计分析使用GraphPad Prism 7软件。采用Student′s t检验法或者单因素方差分析法分析处理组与对照组实验所得数据。用均值±标准差来表示所得数据。p<0.05表示存在统计学意义。结果:1.PRMT5在膀胱癌组织和细胞中高表达。PRMT5在膀胱癌组织中高表达,80例膀胱癌组织中有36例(45%)呈PRMT5高表达,10例癌旁正常膀胱组织中有2例(20%)为PRMT5阳性表达。10组配对样本中,8组为肿瘤组织PRMT5蛋白表达量高于癌旁正常膀胱组织。10组均为肿瘤组织PRMT5 mRNA表达量高于癌旁正常膀胱组织。膀胱癌细胞系中PRMT5的表达量高于正常膀胱细胞。分析TCGA数据库收录的402例膀胱癌患者PRMT5 RNA seq数据与临床病理因素相关性,发现PRMT5表达量高的患者生存时间较短,且患者组织中PRMT5的表达量与肿瘤的病理T分期呈正相关性。2.PRMT5促进膀胱癌细胞增殖。T24及UM-UC-3细胞中敲除PRMT5基因,细胞数目以及集落数目明显减少,转染PRMT5质粒恢复其表达水平后,细胞及集落数目有所恢复。在BIU-87及5637细胞中转染PRMT5质粒上调其表达量,与对照组相比,细胞及集落数目增加,同时通过siRNA干扰其表达后,细胞及集落数目均减少。3.PRMT5抑制膀胱癌细胞凋亡。T24细胞中转染siPRMT5后,细胞凋亡水平上升,线粒体膜电位降低。BIU-87细胞中转染PRMT5质粒后,细胞凋亡水平降低,线粒体膜电位升高。PRMT5过表达下调Cleaved-caspase 3的表达量。4.PRMT5激活膀胱癌细胞中NF-κB信号通路。细胞中转染shPRMT5后,NF-κB活性降低。膀胱癌细胞使用PRMT5抑制剂(EPZ015666)处理后,NF-κB活性降低。膀胱癌细胞中下调PRMT5表达量或抑制其活性后,细胞中BCLXL以及c-IAP1的表达量下调。染色质免疫共沉淀实验结果显示PRMT5活性受到抑制后影响了NF-κB p65对BCLXL和c-IAP1启动子区域的富集。5.PRMT5促进膀胱肿瘤增殖。构建C57BL/6J小鼠膀胱肿瘤,并用PRMT5抑制剂EPZ015666对小鼠进行灌胃处理。EPZ015666灌胃组小鼠肿瘤体积和重量明显变小。膀胱肿瘤组织中BCLXL以及c-IAP1的表达量明显降低。结论:PRMT5在人类膀胱癌组织和细胞系中高表达。膀胱癌患者组织中PRMT5表达量与患者的总生存时间呈负相关性。PRMT5促进膀胱癌细胞的增殖,维持细胞的线粒体膜电位,抑制膀胱癌细胞的凋亡。PRMT5激活膀胱癌细胞中NF-κB通路,上调其靶基因凋亡抑制因子BCLXL和c-IAP1的表达量。在小鼠膀胱肿瘤模型中,PRMT5抑制剂EPZ015666抑制肿瘤生长,抑制BCLXL及c-IAP1的表达。PRMT5可以作为膀胱癌治疗策略中一个新的靶点。