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缺血性脑损伤是临床上常见疾病,在世界人口死亡疾病谱中排名第二,严重威胁着人类健康。根据世界卫生组织报告,每年约有570万人因该疾病致残、致死,给社会和家庭造成沉重经济负担。该疾病的发病原因主要是脑组织供血中断,短时间内不能恢复血供引起。在临床上,早期溶栓恢复血供是其基本治疗策略。然而,研究认为,人脑在缺血超过4.5h后,虽然恢复血供,但可激发细胞产生级联反应引起缺血后的再灌注损伤。遗憾的是临床上患者的治疗绝大多数已经错过这一时间窗,因此常见的缺血性脑损伤多数为再灌注损伤。目前有关脑缺血再灌注损伤的致病机制主要有氨基酸兴奋性毒性、自由基损伤、钙离子超载、炎症反应、细胞凋亡等各种病理机制学说。深入研究这些发病机及干预策略成为治疗脑缺血再灌注损伤急需解决的问题。近年研究发现,一种中枢神经系统突触后膜骨架蛋白—Homer蛋白在许多中枢神经系统疾病中发挥重要作用。作为突触后膜骨架蛋白,Homer蛋白是参与突触构成及介导神经信号转导作用的一类关键蛋白分子。其中,研究最为广泛的是Homer1蛋白。通过即早型基因和构成型基因的不同编码表达,Homer1主要分为Homer1a和Homer1b/c两种蛋白。Homer1a蛋白属于即早基因表达,生理条件下几乎不表达,神经元细胞损伤或者被刺激后启动快速表达,而Homer1b/c蛋白则属于构成型蛋白,在体内常规表达。两种蛋白在功能上相互具有拮抗性调节作用。因Homer1蛋白可以调节突触后膜受体丛集、细胞内钙离子稳态,形成连接复合体等作用,临床前实验研究已经暗示Homer1蛋白与许多中枢神经系统疾病有关。在前人实验研究中发现,颅脑创伤性损伤、细胞氧糖剥夺模型损伤中均可发现Homer1a蛋白早期快速高表达,而Homer1b/c蛋白恒定表达。并且深入研究发现,这种高表达的Homer1a蛋白可以通过负性调节并拆解Homer1b/c蛋白参与形成的各种蛋白复合体,从而抑制诸如兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙离子超载等损伤而发挥神经保护作用。因此我们猜测,在脑缺血再灌注损伤中,可能同样存在该种作用机制,而这种研究在动物实验中却未见报道。本实验的目的是期望应用Homer1a基因敲除小鼠,敲除Homer1a蛋白表达,从而在动物实验中明确Homer1a在脑缺血再灌注损伤中的作用,以及初步探索该作用的机制。实验一Homer1a基因敲除小鼠的繁殖培育与基因鉴定目的:繁殖培育及鉴定Homer1a基因敲除小鼠。方法:通过应用由美国约翰霍普金斯大学Paul F.Worley教授赠送的Homer1a基因敲除种鼠进行配对繁殖,并通过鼠尾提取基因组进行PCR及凝胶电泳鉴定子鼠基因型。结果:共繁殖培育子鼠142只,其中野生型小鼠42只,杂合子型小鼠79只,Homer1a基因敲除纯合子小鼠21只。结论:本实验结果表明,成功繁殖并鉴定出野生型及基因敲除型小鼠,为后续试验提供了可靠的实验动物来源。实验二Homer1a在小鼠局灶性缺血再灌注脑损伤中的保护作用及对星形胶质细胞活化影响目的:通过比较Homer1a基因敲除小鼠与野生型小鼠,明确Homer1a蛋白在小鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用,及对星形胶质细胞活化的影响。方法:取雄性Homer1a基因敲除(Knock Out,KO)小鼠及同窝野生型(Wild Type,WT)小鼠,分为基因敲除假手术组(Sham Knock Out,SKO)、野生型假手术组(Sham Wild Type,SWT)、基因敲除缺血再灌注损伤模型组(Model Knock Out,MKO),野生型缺血再灌注损伤模型组(Model Wild Type,MWT)四组,进行m NSS行为学检测、HE染色观察脑组织细胞形态学、TTC脑梗死体积百分比计算、TUNE凋亡检测及GFAP荧光染色。结果:可以通过HE染色观察到梗死区细胞水肿、崩解、细胞稀疏,核固缩等。小鼠脑缺血再灌注损伤后,比较Homer1a基因敲除小鼠与野生型小鼠发现,基因敲除小鼠行为学损伤加重、脑梗死体积百分比升高、细胞凋亡率增高。脑缺血再灌注损伤后,小鼠星形胶质细胞GFAP免疫荧光阳性细胞数升高,然而Homer1a基因敲除小鼠GFAP免疫荧光染色阳性细胞数较野生型组少。结论:敲除Homer1a基因后,可加重小鼠脑缺血再灌注损伤,说明Homer1a蛋白在脑缺血再灌注损伤中具有保护作用。Homer1a基因敲除降低了星形胶质细胞活化,提示,星形胶质细胞可能参与并发挥复杂作用。