论文部分内容阅读
小檗碱(BBR)是常用清热解毒药黄连的主要活性成分,能显著降低糖尿病患者和动物血糖,减轻体重,改善糖耐量和胰岛素抵抗。体内沉默信息调节因子1(Sirt1)是一种去乙酰化酶,在抗炎和调节敏感性脂肪组织糖脂代谢相关信号通路中与BBR作用靶点和生物学效应基本一致。因此,本文以3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢紊乱为切入点,体外干扰Sirt1表达,探明BBR改善糖代谢是否依赖于Sirt1,为BBR的作用机制提供新的线索。目的:体外培养3T3-L1脂肪细胞,探明小檗碱对脂肪细胞Sirt1蛋白表达和糖代谢及其相关通路蛋白表达的影响是否依赖于Sirt1的介导。方法:1)Western Blot和荧光定量PCR检测不同浓度(1、5、10μMol/L)小檗碱对3T3-L1脂肪细胞中Sirt1表达的影响;2)将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞用Sirt1抑制剂Ex527或慢病毒1v-Sirt1干扰Sirt1蛋白表达后分为四组,对照组,BBR组,Ex527(或1v-Sirt1)组,Ex527(或1v-Sirt1)+BBR组,作用24h后更换含1nM胰岛素和0.2%BSA的无酚红低糖培养基作用1Oh,收取细胞上清液,采用葡萄糖氧化酶法检测细胞的上清液中葡萄糖含量,以无酚红高糖培养基中糖含量相减,即为各组细胞葡萄糖消耗量;3)按2)将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞分为四组,提取蛋白采用Western Blot检测脂肪细胞中LKB1ser428、AMPK-αThr172、ACCser79的磷酸化蛋白表达,免疫沉淀检测PGC-1α的乙酰化表达;4)将诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞分为六组,其中三组用Ex527预处理1h,同时加入TNF-α或合并加入5μMol/LBBR,分别为对照组,TNF-α组,TNF-α+BBR组,Ex527 组,Ex527+TNF-α 组,Ex527+TNF-α+BBR 组,作用 24 后,弃上清,用含有 1nmol/L Insulin 的 0.2%BSA DMEM 处理 15min 后加入 30μM 2-NBDG 和 1 μg/mlDAP2荧光探针的PBS 37℃孵育2h,用高内涵细胞成像仪拍照并计算脂肪细胞平均荧光强度;5)按4)将诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞分为六组,分别为对照组,TNF-α组,TNF-α+BBR组,Ex527组,Ex527+TNF-α组,Ex527+TNF-α+BBR组,作用24h,Western Blot检测AKTser 473与IRS-1Y612磷酸化表达。结果:1)BBR可显著上调3T3-L1脂肪细胞中Sirt1蛋白和基因的表达,且5μMol/LBBR作用最为显著(P<0.05);2)BBR与正常组相比,BBR明显增加葡萄糖消耗(P<0.05),但在Sirt1被Ex527抑制或被1v-Sirt1敲减后,BBR增加葡萄糖消耗这一作用明显减弱;3)BBR 明显增加 LKB1ser428、AMPK-αThr172、ACCser79 的磷酸化表达,并降低 PGC-1乙酰化水平,但在Sirt1被抑制或敲减后,BBR这一作用被减弱;4)与正常组比较,TNF-α刺激后葡萄糖吸收减弱(P<0.05),BBR处理后,葡萄糖摄取增加50%(P<0.05),然而Sirt1被抑制后,BBR增加葡萄糖摄取作用减弱(P<0.05);5)BBR有效恢复炎症因子TNF-α抑制下AKTser473活性损伤,而Sirt1被抑制或敲减后,BBR恢复AKT活性的作用减弱,然而BBR对IRS-1Y612的影响未见明显变化。结论:小檗碱依赖于Sirt1激活AMPK/AKT通路改善3T3-L1脂肪细胞糖代谢。