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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是食源性病原菌中研究的焦点,具有可以形成生物膜的能力,其被膜菌群体耐药性极强并难以彻底清除,对食品工业生产影响极大。乳糖酸(Lactobionic acid,LBA)被归类为一种在自然界中较少见的仿生酸,由结合到半乳糖上的多羟基葡萄糖醛酸组成,如今以其抗氧化性、抗菌性、螯合、稳定、酸化作用及抑菌性而闻名,是一种多用途的食品添加剂。为进一步研究乳糖酸的生物膜抑制特性,本课题研究乳糖酸对S.aureus生物膜的作用效果及作用机制。主要结果如下:(1)通过结晶紫染色鉴定生物膜的黏附能力发现,24 h的生物膜的粘附形态为体积较小的细菌簇,局部可见依旧散落的单个菌体。随着培养时间达到3 d,盖玻片表面的紫色菌团量开始增多,生物膜面积也逐渐增大,呈现致密且均匀的片状结构,生物膜内活菌数达到最大,活性较好。7 d的样本发现当生物膜积累到一定厚度,会发生不同程度的脱落与局部解离。(2)乳糖酸对S.aureus的MIC值为8 mg/mL,MBC值为32 mg/mL,对S.aureus生物膜的MBIC值为16 mg/mL,MBBC>128 mg/mL,表明乳糖酸对S.aureus有良好的抑菌和抑膜效果。银染法及结晶紫黏附试验发现与对照组相比,在乳糖酸的MIC作用下,S.aureus生物膜的形成减少到了56%。从SEM及CLSM图像中,随着处理浓度的提高,观察视野内膜样黏附物质逐渐减少证明生物膜量的减少,MIC处理组菌体表面几乎没有可见黏附物质,几乎无菌体聚集且CLSM发现生物膜样本中出现死亡菌体,直观证明乳糖酸对S.aureus生物膜的抑制作用。(3)利用蒽酮比色法测定乳糖酸处理后S.aureus生物膜模型中胞外多糖含量,荧光染色法鉴定胞外蛋白,并浓缩提取胞外DNA进行含量测定均呈现显著的下降趋势,细胞膜外蛋白随乳糖酸的添加发生猝灭,其构象受到影响。S.aureus的表面疏水性、代谢活性、运动能力及ATPase活性均受到显著下降,抑制生物膜的形成。此外,S.aureus溶血素分泌量的减少可间接证明乳糖酸对群体感应及生物膜形成的干预。(4)研究通过RT-PCR探究乳糖酸对S.aureus生物膜相关基因表达的影响发现,乳糖酸抑制了icaA、icaR、agrA、sigB、hla基因的表达并上调了luxS基因的表达,结果证明乳糖酸可以通过调控ica操纵子的表达抑制胞外多糖的产生,并影响群体感应系统进一步抑制溶血素的释放。通过iTRAQ对差异表达蛋白进行分析得到有统计意义学的差异蛋白274个,其中164个差异蛋白显示为上调,110个蛋白在乳糖酸处理后发生下调。在其中选取了特殊差异蛋白进行分析发现乳糖酸在生物膜形成初期,影响自溶素的表达,间接抑制了eDNA释放并溶解菌体加速死亡。随着乳糖酸的添加,表面锚定蛋白分泌受到影响,细菌菌体生物膜的黏附和侵染均受到抑制。除此之外,乳糖酸显著抑制了S.aureus毒力因子的表达并影响生物膜的形成及宿主侵染。