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研究背景与目的:
世界卫生组织下属国际癌症研究机构(IARC)出版的《全球癌症报告》公布的最新全球癌症统计数据显示，2018年全球将有1810万癌症新发病例，全球癌症的负担将进一步加剧。而肺癌的发病率与死亡率在所有癌症中均位列首位(11.6％，18.4％，2018)。其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)病例在总的肺癌病例中占比率高达85％，并且这类癌症的5年生存率很低，仅有15％。造成恶性肿瘤患者高死亡率的主要因素就是肿瘤发生了转移。恶性肿瘤细胞发生浸润转移过程中的一个重要事件就是上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。在多种癌症中已经证实TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)介导的信号通路是肿瘤细胞诱发EMT的重要途径。RGS6(Regulator of G protein signaling 6)是G蛋白信号通路的关键调控因子RGS蛋白家族中的一员。RGS6作为G蛋白信号通路的关键调控因子，参与许多重要的生理过程和肿瘤的发生。比如在乳腺癌组织中，RGS6表达水平显著下调，并且在乳腺癌细胞中过表达RGS6会导致细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加，进而激活ATM-p53信号通路诱导癌细胞凋亡。我们对收集的NSCLC组织样本分析的结果证实:与癌旁组织相比，RGS6在NSCLC组织中表达显著下调。但是在NSCLC中RGS6是否能抑制肿瘤的增殖和TGF-β1诱导的EMT及其调控机制我们尚不清楚。本研究旨在初步探究NSCLC中RGS6在TGF-β1诱导的EMT过程中的作用，为NSCLC的发生和转移的机制以及后续治疗提供一定的理论基础。
研究方法:
(1)实时定量PCR检测72对非小细胞肺癌与癌旁组织中RGS6的mRNA表达水平，使用Graphpad软件进行后续数据分析。(2)在A549和SPC-A1细胞中瞬时转染RGS6过表达质粒，并利用实时定量荧光PCR和WesternBlot分析RGS6在mRNA和蛋白水平过表达效果。(3)用外源TGF-β1处理A549和SPC-A1细胞，使用实时定量荧光PCR和WesternBlot检测Snail、R-SMAD以及其他蛋白的表达。(4)利用Transwell细胞迁移侵袭实验以及WoundHealing实验来检测体外细胞侵袭与转移的能力。(5)利用CellCountingKit-8CellCycleandApoptosisAnalysisKit检测RGS6对细胞增殖能力和周期的影响。
(6)利用慢病毒载体构建RGS6稳定过表达和敲除的NSCLC细胞株。
研究结果:
(1)NSCLC组织与旁组织相比，在癌组织中的RGS6表达水平显著下调(p＜0.001)。并且在肺癌中RGS6高水平表达与更好的NSCLC患者预后相关。(2)在A549和SPC-A1细胞中过表达RGS6能抑制TGF-β1诱导的EMT过程。(3)在NSCLC细胞中过表达RGS6能抑制TGF-β1/SMAD信号通路的传导，后续WesternBlotting结果显示能抑制R-SMAD的磷酸化以及Snail的表达。(4)在A549和SPC-A1细胞中过表达RGS6能抑制TGF-β1诱导的侵袭和转移。(5)在A549及SPC-A1细胞中过表达RGS6后，细胞周期实验检测结果显示:相比于对照组，细胞的S期比例显著减少，G1期比例显著增加，并能抑制细胞的增殖能力。
研究结论:
本研究揭示了在NSCLC组织中RGS6表达水平显著下调，并且患者低表达RGS6与不良的预后相关。在NSCLC细胞株中，过表达RGS6能抑制细胞的增殖能力并能抑制TGF-β1/SMAD信号通路传导的新功能。进一步发现RGS6能抑制R-SMAD磷酸化进而抑制TGF-β1诱导NSCLC细胞的上皮-间质转化(EMT)过程。本文通过对RGS6与TGF-β1/SMAD信号通路之间相互作用的研究，初步阐明可能的作用机制，为临床上更有效地实现对TGF-β1信号通路诱导的NSCLC转移的抑制提供一定的理论依据。
世界卫生组织下属国际癌症研究机构(IARC)出版的《全球癌症报告》公布的最新全球癌症统计数据显示，2018年全球将有1810万癌症新发病例，全球癌症的负担将进一步加剧。而肺癌的发病率与死亡率在所有癌症中均位列首位(11.6％，18.4％，2018)。其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)病例在总的肺癌病例中占比率高达85％，并且这类癌症的5年生存率很低，仅有15％。造成恶性肿瘤患者高死亡率的主要因素就是肿瘤发生了转移。恶性肿瘤细胞发生浸润转移过程中的一个重要事件就是上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。在多种癌症中已经证实TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)介导的信号通路是肿瘤细胞诱发EMT的重要途径。RGS6(Regulator of G protein signaling 6)是G蛋白信号通路的关键调控因子RGS蛋白家族中的一员。RGS6作为G蛋白信号通路的关键调控因子，参与许多重要的生理过程和肿瘤的发生。比如在乳腺癌组织中，RGS6表达水平显著下调，并且在乳腺癌细胞中过表达RGS6会导致细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加，进而激活ATM-p53信号通路诱导癌细胞凋亡。我们对收集的NSCLC组织样本分析的结果证实:与癌旁组织相比，RGS6在NSCLC组织中表达显著下调。但是在NSCLC中RGS6是否能抑制肿瘤的增殖和TGF-β1诱导的EMT及其调控机制我们尚不清楚。本研究旨在初步探究NSCLC中RGS6在TGF-β1诱导的EMT过程中的作用，为NSCLC的发生和转移的机制以及后续治疗提供一定的理论基础。
研究方法:
(1)实时定量PCR检测72对非小细胞肺癌与癌旁组织中RGS6的mRNA表达水平，使用Graphpad软件进行后续数据分析。(2)在A549和SPC-A1细胞中瞬时转染RGS6过表达质粒，并利用实时定量荧光PCR和WesternBlot分析RGS6在mRNA和蛋白水平过表达效果。(3)用外源TGF-β1处理A549和SPC-A1细胞，使用实时定量荧光PCR和WesternBlot检测Snail、R-SMAD以及其他蛋白的表达。(4)利用Transwell细胞迁移侵袭实验以及WoundHealing实验来检测体外细胞侵袭与转移的能力。(5)利用CellCountingKit-8CellCycleandApoptosisAnalysisKit检测RGS6对细胞增殖能力和周期的影响。
(6)利用慢病毒载体构建RGS6稳定过表达和敲除的NSCLC细胞株。
研究结果:
(1)NSCLC组织与旁组织相比，在癌组织中的RGS6表达水平显著下调(p＜0.001)。并且在肺癌中RGS6高水平表达与更好的NSCLC患者预后相关。(2)在A549和SPC-A1细胞中过表达RGS6能抑制TGF-β1诱导的EMT过程。(3)在NSCLC细胞中过表达RGS6能抑制TGF-β1/SMAD信号通路的传导，后续WesternBlotting结果显示能抑制R-SMAD的磷酸化以及Snail的表达。(4)在A549和SPC-A1细胞中过表达RGS6能抑制TGF-β1诱导的侵袭和转移。(5)在A549及SPC-A1细胞中过表达RGS6后，细胞周期实验检测结果显示:相比于对照组，细胞的S期比例显著减少，G1期比例显著增加，并能抑制细胞的增殖能力。
研究结论:
本研究揭示了在NSCLC组织中RGS6表达水平显著下调，并且患者低表达RGS6与不良的预后相关。在NSCLC细胞株中，过表达RGS6能抑制细胞的增殖能力并能抑制TGF-β1/SMAD信号通路传导的新功能。进一步发现RGS6能抑制R-SMAD磷酸化进而抑制TGF-β1诱导NSCLC细胞的上皮-间质转化(EMT)过程。本文通过对RGS6与TGF-β1/SMAD信号通路之间相互作用的研究，初步阐明可能的作用机制，为临床上更有效地实现对TGF-β1信号通路诱导的NSCLC转移的抑制提供一定的理论依据。